Virusologiniai tyrimo metodai

Dietos

Virologiniai tyrimo metodai plačiai naudojami medicinoje, siekiant diagnozuoti įvairias infekcines ir kai kurias onkologines virusines ligas.

Virusologiniai tyrimo metodai taip pat naudojami virusams nustatyti, jų biologijai tyrinėti ir gebėjimui elgtis su gyvūnų ir žmogaus ląstelėmis, o tai dar labiau padeda suprasti viruso ligų patogeniškumą ir pasirinkti tinkamus jų gydymo būdus. Be nustatymo ligos etiologijos ir stebint gydymo veiksmingumą, viruso tyrimo metodai yra labai svarbūs nustatant ir vykdant antiepidemines priemones.

Tiesioginiai virusologijos metodai

Tiesioginiai virusologiniai tyrimo metodai leidžia tiesiogiai aptikti virusą, virusinę nukleino rūgštį arba virusinį antigeną klinikinėje medžiagoje ir todėl yra greitesni (greiti metodai - iki 24 valandų). Šie metodai yra mažiau informatyvūs ir reikalauja patvirtinti laboratorinius netiesioginius diagnozavimo metodus, susijusius su dažnai gaunamais klaidingai neigiamais ar klaidingai teigiamais rezultatais. Tiesiogiai įtraukti šiuos tyrimo metodus:

  • elektroninė mikroskopija su viruso dažymu neigiamai kontrastinga (leidžia nustatyti viruso buvimą ir jo koncentraciją medžiagoje, jei 1 ml yra ne mažiau kaip 105 viruso dalelių);
  • imuninė elektroninė mikroskopija, pagrįsta specifinių antikūnų sąveika su virusais, kurių sudėtyje yra kompleksų, kuriuos lengviau aptikti nekontroliuojamais kontrastiniais virusais, atskirai;
  • su fermentais susijusi imunosorbento analizė (ELISA), naudojant fermentu pažymėtus antikūnus, kurie jungiasi prie antigenų, sudarančių kompleksus, kurie nustatomi pridedant fermento substratą;
  • Immunofluorescencijos reakcija (RIF) - tiesioginė ar netiesioginė - grindžiama antikūnų, susijusių su fluorescuojančiu dažikliu, naudojimu;
  • radioimuninė analizė (RIA) pagrįsta radioizotopui žymėtų antikūnų ir gama skaitiklių naudojimu;
  • citologiniai metodai yra pagrįsti mikroskopiniais apipurkštų tepinėlių, biopsijų, autopsijų medžiagų tyrinėjimais;
  • molekuliniai metodai - nukleorūgščių ir polimerazės grandininės reakcijos molekulinė hibridizacija (pirmoji remiasi komplementarių nukleino rūgšties grandžių identifikavimu naudojant etiketę, antrasis - remiantis viruso specifinės DNR sekos replikacijos principu trimis etapais).

Yra trys nukleino rūgščių molekulinės hibridizacijos variantai: hibridizacija, blotingų hibridizacija (naudojama ŽIV infekcijai diagnozuoti) ir in situ hibridizacija (tiesiogiai infekuotose ląstelėse). Šiuo metu vis dažniau naudojama PCR (polimerazės grandininė reakcija) stebint ir diagnozuojant virusines infekcijas dėl šio metodo didelio jautrumo ir specifiškumo.

Netiesioginiai virusologiniai tyrimo metodai

Šie metodai yra pagrįsti viruso išskyrimu ir identifikavimu. Tačiau tai yra daug laiko ir ilgų metodų, tačiau tiksliau. Už tokių tyrimų medžiaga gali būti iš pūslelių, nuograndų (vėjaraupių, Herpetic pakitimų odos ir gleivinės), nosiaryklės plauti (kvėpavimo takų infekcijos), kraujo ir smegenų skysčio (už arbovirus infekcijų), išmatų (už enteroviruso infekcijų) Praplovos turinys (su tymai, raudonukės ir kt.). Atsižvelgiant į tai, kad virusai gali daugintis tik gyvų ląstelių auginimą virusas atliekamas audinių kultūros, viščiuko embriono ar gyvūno (žiurkėnai, baltos pelės, šunys, katės, kai beždžionių rūšys) kūną. Viruso, kurį perneša citopatinio poveikio, atsakant gemadsorbtsii nuo spalvos mėginyje, iš hemagliutinacijos slopinimo rezultatų, dėl pakeitimų ar jos neturėjimu, viščiuko embriono arba audinių kultūras, išgyvenimo jautrių gyvūnų požymių.

Serologiniai diagnostikos metodai, naudojami virusologijoje

Pagal serologinę diagnozę nurodomi virusologiniai tyrimo metodai, pagrįsti antigeno antikūnų reakcija. Šiuo atveju dažniausiai naudojamas susietas serumas, kuris vartojamas po kelių savaičių. Jei antikūnų titras padidėja 4 ar daugiau kartų, reakcija laikoma teigiama. Siekiant nustatyti viruso tipo specifiškumą, siekiant nustatyti grupės specifiškumą, naudojama viruso neutralizavimo reakcija, yra komplemento susiejimo reakcija. Taip pat plačiai naudojamos pasyvios hemagliutinacijos reakcijos, hemagliutinacijos slopinimas, atvirkštinės pasyviosios hemagliutinacijos, FTA ir įvairios fermentinio imuninio tyrimo galimybės.

Gana neseniai buvo sukurta monokloninių antikūnų gamybos technologija genetinių inžinerijos tyrimuose. Siauras monoklonų specifiškumas yra įveiktas, naudojant keletą monokloninių antikūnų skirtingiems virusų veiksniams. Tai padidino virusologinių tyrimų metodų jautrumą ir specifiškumą nustatant virusinius antigenus. Šiuo metu sukurta daugybė skirtingų virusinių infekcijų imunologinės diagnostikos sistemų.

Virusų tyrimo metodai.

loading...

Istoriškai virusologija susilpnėjo nuo mikrobiologijos ir nors mikrobiologinis metodas negalėjo būti naudojamas dirbant su virusais, pagrindiniai nauji mokslo pagrindai buvo tokie bendrieji principai kaip aseptikos taisyklės, švarių linijų gavimas, titravimo metodai ir galiausiai vakcinavimas. Tolesnis svarbiausių virusų savybių tyrimas reikalauja tam tikrų specialių metodų kūrimo. Taigi, virusų gebėjimas praeiti per bakterinius filtrus buvo naudojamas jų dydžiui ir valymui nustatyti, mažas virusų dydis paskatino kurti pažangesnius mikroskopijos metodus. Technologinis virusologijos arsenalas pamažu praturtintas fizikos, chemijos, genetikos, citologijos, molekulinės biologijos ir imunologijos metodais.

Virusas galėjo matuoti ir sverti, nustatyti jų cheminę sudėtį, reprodukcijos modelius, jų vietą gamtoje, jų vaidmenį atsirandant ligoms, taip pat sukurti veiksmingus kovos su virusinėmis infekcijomis metodus. Virusai auginami specialiais metodais, užkrėsdami laboratorinius gyvūnus, viščiukų embrionus ir audinių kultūrą. Virusologijos aušros metu buvo tiriami laboratoriniai gyvūnai (balta pelės, jūrų kiaulytės, triušiai). Jie buvo injekuojami "įtartina medžiaga" ir vertinami pagal ligos, kurią šis virusas sukėlė, paveikslą. Virusų reprodukcijai ir izoliavimui pradėjo naudoti ne tik laboratoriniai gyvūnai, bet ir vištienos embrionai, kuriuose kai kurie virusai dauginasi, kaupiasi, o kartais ir dideliais kiekiais.

Nuo XX a. 50-ųjų pradžios buvo sukurtas audinių kultūros metodas: gyvųjų audinių ląstelės buvo atskirtos naudojant fermentus, perkelti į specialų sterilų indą, papildyti sudėtingos sudėties kompozicija maistine terpe ir įdėti į augimo termostatą. Ląstelės pradeda dalytis ir palaipsniui padengti stiklo paviršių lygiu pastoviu sluoksniu. Jei tokios ląstelės užkrėstos virusu, galite tiesiogiai stebėti jų destruktyvų poveikį. Audinių kultūros metodas leido atrasti naujus virusus ir tyrinėti virusų ir ląstelių sąveiką.

Pagrindiniai virusologijos metodai yra virusų rūšių išskyrimas, dauginimas ir nustatymas. Paprastai šį darbą sudaro dvi pagrindinės dalys: viruso infekuotų ląstelių tyrimas ir izoliuotų virusų tyrimai.

Norint nustatyti užkrėstas ląsteles, naudojami įvairūs virusologinės diagnostikos metodai: fluorescuojančių antikūnų metodas, leidžiantis aiškiai nustatyti virusų buvimą ląstelėse, kurios iš išorės atrodo neinfekcinės; būdas atsižvelgti į virusų reprodukcijos greitį ir pobūdį, pagrįstas ląstelių sunaikinimu (pilna arba daline). Svarbus vaidmuo nustatant virusines infekcijas atliekamas nustatant specifinių antikūnų titrus serume pacientų, vartojančių įvairias imunologines reakcijas: neutralizavimą, komplemento susiejimą, uždelstą hemagliutinaciją ir kt.

ΙΙ. Vizijų struktūros ir reprodukcijos ypatumai

Ilgą laiką virusų egzistavimas buvo vertinamas dėl ligų sukeliančių veiksmų. Tai buvo įmanoma tiesiogiai pažvelgti į virusus tik po elektroninio mikroskopo išradimo, padidindamas dešimtis ir šimtus tūkstančių kartų. Tai įvyko apie 50 metų po virusų atradimo.

Didžiausi virusai artėja prie mažų bakterijų dydžio, mažiausių - didelių baltymų molekulių, pavyzdžiui, hemoglobino molekulės kraujyje. Kitaip tariant, tarp virusų yra milžinai ir nykštukai. Vertinant virusus, naudojančius sąlyginę vertę, vadinamas nanometru (nm). Vienas nanometras yra milijono milimetrų. Skirtingų virusų dydžiai svyruoja nuo 20 iki kelių šimtų nm. Palyginimui mes pateikiame mažiausių kraujo kūnelių - raudonųjų kraujo kūnelių - vertę, lygią 7000-8000 nm, t.y. virusai yra mažiau nei raudonųjų kraujo kūnelių dešimtys ir šimtai kartų. Išvaizda virusų kūnai primena kubus, lazdeles, rutulius, daugiasluoksnes ir sriegius.

Paprasti virusai susideda iš baltymų ir nukleino rūgšties. Svarbiausia virusinės dalelės - nukleorūgšties - dalis yra genetinės informacijos nešėjas. Jei žmogaus, gyvūnų, augalų ir bakterijų ląstelėse visada yra dviejų tipų nukleino rūgščių - dezoksiribonukleinių - DNR ir ribonukleicinių - RNR, tada tik vienas tipas yra randamas skirtinguose virusuose - DNR arba RNR, kuri yra jų klasifikavimo pagrindas. Antras esminis viriono komponentas yra tai, kad baltymai skiriasi skirtingais virusais, todėl juos galima atpažinti imunologinėmis reakcijomis.

Sudėtingesnė struktūra, virusai, be baltymų ir nukleino rūgščių, turi angliavandenių, lipidų. Kiekviena virusų grupė turi savo rinkinį baltymų, riebalų, angliavandenių ir nukleino rūgščių. Kai kuriuose virusuose yra fermentų.

Kiekvienas virioną komponentas turi specifines funkcijas: baltymų apvalkalo apsaugo nuo neigiamo poveikio, nukleino rūgštis yra atsakinga už paveldimas ir infekcinių savybių ir vaidina pagrindinį vaidmenį viruso kintamumo ir dalyvaujantys fermentai jų reprodukcijai. Paprastai nukleino rūgštis yra viriono centre ir yra apsupta baltos spalvos kauke, tarsi ji būtų apsirengusi. Kapsidą sudaro tam tikra baltymų molekulių forma, kuri sudaro simetrines geometrines figūras kartu su virusų nukleino rūgštimi. Kubinio simetrijos atveju nukleokapsido nukleino rūgšties eilutė sulankstyta į kamuoliuką, o jo kapsomerai yra griežtai supakuoti. Sutvarkyta taip, poliomielitas virusų, snukio ir nagų ligos, adenoviruso, para-, rinovirusų, ir kt. Su spirale (lazdelės formos) simetrija virusas nukleokapsidės nukleino rūgšties kryptis yra susukti į spiralę, kiekvienas iš jo, kuriems capsomeres ruožtu glaudžiai gretimi vienas kitam. Kapsomerų struktūra ir virionų išvaizda gali būti stebima naudojant elektroninę mikroskopiją.

3 paveikslas. Žmogaus imunodeficito viruso (1 - capsomera, 2 - genomo, 3 - lipoproteinų apvalkalo (superkapsido), 4 - glikoprotinės rūšies) struktūra.

Sudėtinguose virusuose griežtai sulenkiamos spiralės forma yra padengta vienu ar keliais išoriniais korpusais, į kuriuos įeina įvairios medžiagos. Tokia struktūra yra, pavyzdžiui, raupų, gripo ir paragripo virusai. Ypač ištirta virusinių bakterijų struktūra - bakteriofagai (fagai), kurie susideda iš galvos ir uodegos. Fagos uodega yra apsirengta baltymų dangteliu, iš kurios ilgai ploni pluoštai atlieka priedų vaidmenį prijungdami fago dalelę prie bakterijų.

Įtraukta data: 2016-06-22; Peržiūrėta: 1281; ORDER RAŠYMO DARBAS

Viruso tyrimo metodai

loading...

VIRUSAS TYRIMAI - tyrimai, skirti diagnozuoti virusines infekcijas, tirti atitinkamus patogenus, jų platinimą gamtoje, taip pat gaminti virusinius vaistus. Virusologijos laboratorijose (žr.) Medus. jie tiria ir žmogaus virusus, ir kai kuriais atvejais gyvūnų virusus (pvz., diagnozuojant pasiutligę šunims, tiriant gyvūnus, naudojamus virusinių preparatų gamybai). Tie ir kiti tyrimo metodai yra panašūs.

Vienas iš pagrindinių V. ir V. etapų. yra virusų izoliacija. Išskyrus virusus nuo žmonių, kraujo, įvairių paslapčių ir išmatų, naudojami organų gabalai. Dažniausiai kraujas tiriamas dėl arbovirusinių ligų. Naudojamas sveikas defibrinis ar hemolizuotas kraujas, jo atskiri elementai arba krešuliai (vėlesniuose ligos etapuose). Trakų virusai, epid, parotiditas, herpes simplex gali būti randami seilėse. Nasopharyngeal plovimas yra naudojamas izoliuoti gripo, tymų, psitakozės, rinovirusų, kvėpavimo sincytial viruso, adenovirusų sukėlėjus. Adenovirusus taip pat randama iš junginių išplovus. Skrandimas atliekamas skalaujant nosį ir gerklę (atskirai) ir konjunktyvą plaunant izotoniniu natrio chlorido tirpalu. Galite nuvalyti nosies kanalus ir sultinio druskos sudrėkintą tamponą. Nesterili medžiaga 30 minučių gydoma antibiotikais (1000 TV penicilino ir streptomicino 1 ml). Skirtingi enterovirusai, adeno- ir reovirusai skiriasi nuo išmatų. Pavyzdžiai, praskiesti 1:10 fosfatiniu buferiu, centrifuguoti du kartus 20 minučių. esant 8000 aps / min I Antibiotikai pridedami kaip nurodyta aukščiau. Rečiau ir dažniau V. ir. paimkite pustulių (raupų, vėjaraupių, herpeso) ir ppunktinių organų (venerinės limfogranulomos) turinį. Atskirti medžiagos turėtų būti imamasi kuo greičiau po organizmo mirties. Jis saugomas tol, kol tyrimas t ° -20 ° ir žemiau. Vykdyti V. ir. audinys smulkinamas (pounded) ir 10-20% suspensija ruošiama izotoniniu natrio chlorido tirpalu arba ląstelių kultūrų kultūros priemone. Centrifuguojama 20 minučių. 1500 rpm; Supernatantas naudojamas tolesniam tyrimui.

Siekiant išskirti virusus, užsikrėtę laboratoriniai gyvūnai, paukščių embrionai, ląstelių ir audinių kultūros. Gyvūnai yra naudingi, jei virusas sukelia jiems aiškius klinikinius ligos ar patologinių pokyčių simptomus (pvz., Paralyžius, pneumonija ir kt.). Nuo viruso tropizmo priklauso nuo medžiagos vartojimo būdas. Plačiai naudojama infekcija po oda, intraperitoniniu būdu ir į veną. Neurotropiniai virusai nustatomi, kai gyvūnai yra užsikrėtę galvos smegenų pusrutuliuose (arbovirusai, pasiutligės virusas ir tt), regėjimo kalvos (poliomielito virusas beždžionių eksperimentuose) ir nugaros smegenų. Rabai ir herpeso virusai gali būti aptikti, naudojant medžiagą triušiams skarituotoje ragenoje. Kai kurie virusai yra lengvai aptikti, kai jie yra užsikrečiami į priekinę akies kamerą (pvz., Šuniukų hepatito virusas). Gyvūnų intranazinė infekcija paprastai naudojama kvėpavimo takų infekcijų sukėlėjų tyrinėjimui (įkvėpimas į nosies anestezuotus gyvūnus arba įvedimas į aerozolį specialioje kameroje). Medžiaga į virškinamąjį traktą patenka į maistą arba per burną su bukas adata. Kai kurių onkogeninių virusų tyrime naudojamas auksinių žiurkėnų infekcijos metodas į žandų maišelių gleivinę.

Daugeliui virusų naujagimiai ir prieskoniai yra jautresni nei lytiniu būdu subrendę asmenys. Inkstų pelės yra plačiai naudojamos izoliuoti arbovirusus ir Coxsackie virusus (po infekcijos smegenyse). Kai kurie adenovirusai gali paskatinti auglius naujagimio auksinių žiurkėnų poodine infekcija. Daugelio paukščių virusų tyrimas atliekamas pirmųjų gyvenimo dienų viščiukų.

Vištienos embrionų naudojimas turi keletą privalumų. Jų nediferencijuoti audiniai turi daugybę jautrumo daugeliui virusų. Infekcijos buvimas yra vertinami pagal embriono mirties, išvaizdą pokyčiai (įdubimų) dėl choriomeningito-alantojo membranos (1 pav.), Skysčių kaupimasis embriono hemaglutinino ir papildyti surišantis viruso antigenui. Embrionų Inokuliuotų dėl chorioalantojo membranos (11 metų amžiaus - 12 dienų raupų viruso grupės) į alantojo ir amniono ertmių (10-11 dienų miksovirusami), trynio maišelio (nuo 5-6 dienas patogenus psittakozaornitoza ir kt.). Medžiaga retai inokuliuojama į smegenis ir į veną (į membranų indus). Su bet kuriuo infekcijos metodu embrionai gali būti traumuojami, todėl per pirmas 24-48 valandas jie mirė. neįtraukti į apskaitą.

Ištirti poveikį virusų cheminei medžiagai. medžiagos yra labai patogu dembrirovannye kiaušiniai, kurie pašalino embrioną, tačiau konservuoti chorioallantoo lukštais. Virusas ir bandomosios medžiagos dedama į 20 ml izotoninio natrio chlorido tirpalą. Korpuso skylė uždaryta su dangteliu su vamzdžiu, per kurį galite paimti mėginius analizei.

Vertinant bandymus su gyvūnais ir paukščių embrionais, reikia turėti omenyje galimybę provokuoti latentines infekcijas arba išskirti latentinį virusą.

Išimtinai plačiai naudojami izoliuoti ir kaupti virusus, naudojamus ląstelių kultūrą ir audinius (žr.). Šie metodai gali ugdyti daugumą žinomų virusų (žr. "Virusų auginimas"). Kai kurie iš jų intensyviai kaupiasi jau pradinės kultūrų infekcijos metu, kitų pritaikymui reikalingos kelios ištraukos. Daugelio virusų dauginimasis ląstelių kultūrose yra kartu su citopatiniu poveikiu. Pagal savo pobūdį, kad tam tikru mastu gali būti vertinama pagal su tam tikra konkrečia lenktynėse virusų: pikornavirusų sukelti suapvalinimo ir ląstelių susitraukimas, adenoviruso - klasterius užapvalinti ląstelių formavimąsi vynuogių kekė forma, miksovirusy ir herpes virusų - multi-core syncytia formavimas. Keli virusai negali būti auginami už kūno.

Kai kurių virusų (raupų grupės, myxo ir arbovirusų) dauginimasis gali būti nustatomas naudojant hemadsorbciją, nes paveiktos ląstelės įgijo galimybę adsorbuoti eritrocitus. Atitinkami eritrocitai (žmogaus, beždžionės, jūrų kiaulytės, vištienos) esant 0,4-0,5% koncentracija dedami ant monosluoksnio esant t ° 4 ° arba kambario temperatūroje 20-30 minučių. Eritrocitai visoje kultūroje adsorbuoja difuziškai (pvz., Paragripo virusai) arba salelių formos (gripo virusai, kiaulytė).

Virusų dauginimas kartais vertinamas tiriant gyvūnų kultūrą (erkinis encefalitas) arba CSC. Viruso, kuris neturi citopatinio aktyvumo, buvimas kartais priklauso nuo jo gebėjimo trukdyti citopatogeniniam virusui. Taigi, viščiukų embrionų ląstelių kultūrose, užsikrėtusiose paukščių leukemijos virusais, Rous sarkomos viruso reprodukcija yra slopinama. Nustatant ne citopatogenines galvijų viduriavimo ir kiaulių choleros virusų štamus, siūloma atlikti END (Niukaslio ligos išsiveržimo) metodą - Niukaslio ligos viruso kultūrų superinfekcija. Kai abu virusai veikia kartu, atsiranda ląstelių naikinimas.

Kai pasireiškia citopatiniai pokyčiai ar kiti viruso dauginimosi požymiai, kultūros skystis yra naudojamas viruso arba praeinamumo nustatymui. Daugybė virusų lieka susijusi su ląstelėmis net ir kultūros degeneracijos metu (adenovirusai, raupų virusai), dėl kurių prieš suvedant skystį atliekamos kultūrų užšalimas ir atšildymas. Kai kuriems herpetiniams virusams, pavyzdžiui, viščiukų Mareko ligos virusui, reikia persodinti kartu su nepažeistomis ląstelėmis.

Norėdami ištirti žmonių kvėpavimo koronijos virusus ir kai kuriuos kitus, jie naudoja audinių kultūros metodą, t. Y. Kultivuotų in vitro audinių fragmentų infekciją. Dažniausiai naudojamas triušio trachėjos audinys. Veisiantis virusas infekuoja gleivinės endotelio ląsteles, o tai lemia cilindrų judėjimo nutraukimas.

Reikėtų atsižvelgti į pašalinių virusų buvimą audinių kultūrose ir ląstelėse. Jie gali būti naudojami su ląstelėmis, jei jie yra paimti iš užkrėsto organizmo, iš tripzino ar serumo, naudojamo ląstelių kultūrai.

Be to, sėjos ar skerspjūvio biopsija medžiaga jau išaugo kultūros taikomi tiesiogiai kultivavimą ląstelės išnagrinėjo organą po tripsinizacijos, dažnai daugiau veiksmingas prieš viruso išskyrimas (pvz., Iš adenovirusą tonzilių aptikimo). Taip pat naudojamas sumaišomi kultūras procedūros, kai testas kūno ląstelės auga kartu su kokiu nors virusu jautriai reaguoja į pateiktus ląstelių (pvz.,, Sėjamosios ląsteles pacientų smegenis su poūmis sklerozinis panencefalitas su beždžionių inkstų ląstelių arba Hela-ląstelių tymų viruso išskyrimas). Mišrios kultūros metodas dažnai yra vienintelis būdas išskirti virusą nuo gyvūno sukeltų navikų, kurie negamina aktyviu virusu, bet turi viruso genomą.

Viengubos ląstelių kultūros leidžia gauti viruso plokštelių kolonijas (2 pav.). Paprastai plokštelės formuoja virusus su citopatiniu aktyvumu. Tuo pačiu metu šis metodas leidžia aptikti kai kuriuos ne-citopatogeninius virusus (pvz., Galvijų diarėjos viruso štamus). Norint gauti plokšteles, virusas į ląstelių monosluoksnį dedamas puodeliuose arba buteliuose. Infekcijos, t. Y. Viruso dalelių vienoje ląstelėje, įvairovė turi būti nedidelė, kad susidariusios plokštelės nesujungtų. Po 30-60 minučių sluoksniuotos adsorbcija vidutinės su 1,35-1,5% agaro, ir neutrali raudona, kurio galutinė praskiedus 1: 000 kultūros 40 Petri plokščių yra inkubuojamos atmosferoje su 5-10% anglies dioksido, ir hermetiškai uždaryti buteliukai - įprastu orkaitėje. Po keleto dienų nenuosekliosios degeneracinių ląstelių kampai pradeda išsiskirti iš in vivo įterptų ląstelių.

Ląstelėse galima įdėti agarą be neutralios raudonos spalvos, o po kelių dienų pridėti antrą dažų agaro sluoksnį; plokštelės tampa matomos po kelių valandų. Agaras kartais yra polisacharidų sulfatų, kurie yra virusų augimo inhibitoriai; Siekiant neutralizuoti, į terpę pridedamas protamino sulfatas (60 mg 100 ml). Kad gautumėte daugelio virusų plokštelių, metilceliuliozė ir kitos medžiagos gali būti naudojamos kaip danga. Kai kurie virusai (raupai, tymai) sudaro plokšteles be agaro. Plokštelių metodas leidžia kloninę virusinių štamų analizę. Kad išskirtų genetiškai vienodus klonus, pašalinama viena plokštelė, kuri naudojama kitai infekcijai. Paprastai klonavimas atliekamas trims fragmentams.

Apnašų metodas taip pat tinkamas nustatant ląstelių, gaminančių virusą užkrėstoje kultūroje (t.y., infekcinių centrų skaičių), skaičių. Norėdami tai padaryti, ląstelės yra suspenduotos, dedamos ant virusų jautrių indikatorinių ląstelių vienos sluoksnio kultūros ir išpilamos agaru. Plokštelės susidaro aplink užkrėstoms ląstelėms.

Norėdami diagnozuoti virusines infekcijas ir ištirti antigeninę virusų struktūrą, naudojama gelio nusodinimo reakcija. Šiuo tikslu dažniausiai naudojamas agaras. Antigenai ir specifiniai antikūnai, dedami ant tam tikro atstumo ant agaro gelio, skleidžiami ir formuojasi susidarius baltos juostelės nuosėdoms. 0,8-1% agaro izotoniniame natrio chlorido arba fosfatinio buferinio tirpalo tirpalui dedamas į kapiliarus arba dedamas ant stiklinio stiklelio. Antikūnai geriau išgryninti ir koncentruoti. Reakcijos sudedamosios dalys dedamos į agarą priešinguose kapiliarų galuose arba į agaro sluoksnyje pagamintus šulinius 5-6 mm atstumu. Inkubacija trunka 4-20 valandų.

Didelė dalis B. ir. atlikti naudojant šviesos ir elektronų mikroskopą. Didžiausius virusus (pavyzdžiui, raupus) po tinkamo apdorojimo (sidabro, tapybos Viktorijos ir kt.) Galima aptikti taikant įprastinę šviesos mikroskopiją. Šis metodas naudojamas raupų diagnozei tiriant pustulių medžiagą. Kai kurių infekcijų charakteristika yra ląstelių formavimas ląstelėse - intarpai. Taigi, branduoliuose atsiranda inkliuzai herpeso ir adenoviruso infekcijų atveju, citoplazmoje - raupų (Guarnieri veršelyje) ir pasiutligės (Babesh kūno - Negri). Įtraukimų nustatymas yra svarbus pasiutligės, raupų, citomegalijos, poodinio sklerozinio panencefalito ir tt diagnozei.

Mikroskopija tamsoje (žr. "Darkfield" mikroskopija) ir fazinio kontrasto mikroskopija (žr.) Naudokite hl. arr. ištirti virusų užkrėstų ląstelių pokyčių dinamiką. Plačiau naudojama fluorescencinė mikroskopija (žr.).

Išnagrinėkite tepalus, spaudinius ir viengubas ląstelių kultūras, auginamas ant stiklo. Preparatai (natūralūs arba fiksuoti) dažniausiai dažomi oranžiniu akridinu. Šis metodas leidžia aptikti didelius virusų ir virusinių komponentų grupes. Formacijos, kuriose yra DNR švytėjimas su ryškia žalia šviesa, ir tie, kuriuose yra RNR, yra plytos. Dažniau su V. ir. Užkrėstų ląstelių apdorojimas fluorescuojančiais antikūnais leidžia jums nustatyti viruso antigeno grupes. Tiesioginiu būdu naudojamas imuninės gama-globulinas, paženklintas fluorescuojančiu dažikliu, pavyzdžiui, fluoresceino izotiocianatu. Netiesioginiu būdu vaistas gydomas normaliu bet kurio gyvūno imuniniu serumu, o po to žymimas antikūnais prieš šio gyvūno gama globuliną. Preparatai tiriami ultravioletinių spindulių šviesoje, viruso antigenas aptinka šviesiai žalią šviesą (žr. "Immunofluorescencija"). Niežulys iš nasopharynx leidžia anksti diagnozuoti kvėpavimo takų virusines infekcijas - gripą, paragriptinę, rino- ir adenovirusą, kvėpavimo sistemos sincitiką.

Elektroninė mikroskopija (žr.) Leidžia ištirti viruso dalelių dydį ir struktūrą, taip pat subtilius pokyčius, kuriuos jie sukelia ląstelėse. Ištirkite virusinę suspensiją arba ultrathin dalis infekuotų ląstelių. Kai kurie virusai (pavyzdžiui, serija žmogaus ir gyvūno onkornavirusų) audiniuose gali būti aptiktas tik šiuo metodu.

B. ir., Kurių tikslas yra nustatyti viruso ar virusinių antikūnų kiekį (titras), yra labai įvairus.

Pagal elektroninį mikroskopą, jei yra pakankamai švarus, galima apskaičiuoti viruso dalelių skaičių suspensijoje. Virusas sumaišomas su polistirolo lateksu, žinoma dalelių skaičius. Mišinys purškiamas ant grotelių, dalelių skaičius skaičiuojamas atskirais lašais. Latekso ir virusų dalelių santykis atskleidžia virionų skaičių tam tikrame tūriui. Šis metodas nesuteikia supratimo apie infekcinę viruso veiklą, nes virusinėje suspensijoje paprastai yra daug neinfekcinių dalelių.

Labiausiai tiksliai nustato infekcinių vienetų skaičių medžiagoje, leidžiantį naudoti plokštelių metodą. Viengubos ląstelių kultūros infekuoja nedidelę viruso dozę. Tibras yra išreiškiamas plokštelių formavimo vienetų (PFU) skaičiumi 1 ml. Panašiu būdu galima nustatyti tam tikrų onkogeninių virusų titrą transformacijos kampelėmis, taip pat tuos patogenus, kurie formuoja bites ant chicken embrionų chorioallantoo membranos (pvz., Raupų ​​viruso).

Viruso titras pagal galutinį praskiedimo metodą yra ne toks tikslus. Sėkmingai didinant skiedimą (paprastai dešimt kartų) įleidžiami jautrūs gyvūnai, viščiukų embrionai arba ląstelių kultūros. Atsižvelgiant į kiekvieno administravimo kaip teigiamą ar neigiamą rezultatą, jie nustato mažiausią viruso dozę, galinčią sukelti tam tikrą poveikį (gyvūno liga ar mirtis, citopatinių pokyčių atsiradimas kultūroje ir kt.). Praktiškai šią dozę sunku nustatyti, todėl apskaičiuokite dozę, kuri turi 50% efektą (ED50) Jis nustatomas priklausomai nuo viruso savybių ir titravimo metodo mirusiųjų gyvūnų skaičiumi (LD50), atvejų skaičius (ID50), embrionų skaičius, kuriame atsirado viruso hemagliutininų arba komplementą surišančių antigenų skaičius, atsižvelgiant į ląstelių kultūrų skaičių, kuriame buvo nustatyti citopatiniai pokyčiai arba hemadsorbuojantis aktyvumas. Tibras išreiškiamas ED50 skaičiumi tam tikrame medžiagos kiekyje.

Iš esamų ED50 skaičiavimo metodų dažniausiai naudojamas Reed-Munch metodas, pagrįstas kumuliacijos principu. Jis grindžiamas prielaida, kad kiekvienas bandomasis objektas (pelė, embrionas), kuris teigiamai reagavo į šio skiedimo įvedimą, reaguos į teigiamą reakciją į labiau koncentruoto viruso įvedimą. Ir atvirkščiai, jei šis atskiedimas sukėlė neigiamą reakciją, tada įvedus didesnį praskiedimą, taip pat bus neigiama reakcija. Skilimo intervalai tarp šio metodo turėtų būti vienodi, kiekvieno praskiedimo metu užkrėstos mažiausiai 4 gyvūnai (kultūros). Tada interpoliuoti tarp dozių, kurių poveikis yra arčiausiai 50%. Skaičiavimas atliekamas pagal formulę:

kur B yra mažiausia dozė, kurios poveikis buvo didesnis nei 50%, b - dozės B poveikis procentais, o didžiausia dozė, kuri sukelia poveikį, yra mažesnė nei 50% procentais, d - intervalas tarp dviejų gretimų dozių logaritmų.

Virusai su ryškiu citopatiniu aktyvumu (pvz., Poliomielito virusu) gali būti titruojami naudojant spalvinį tyrimą. Tai grindžiama tuo, kad ląstelių augimo metu terpės pH mažėja, o infekuotose kultūrose, kur ląstelės išsigimsta, terpės pH nesikeičia. Norint identifikuoti šiuos pokyčius, indikatorius pridedamas prie vidutinės fenolio raudonos, raudonos spalvos, kai pH yra didesnis kaip 7, oranžinės spalvos esant pH 7 ir geltonos, kai pH yra mažesnis kaip 7. Maistinėje terpėje, kurios pH yra 7,3-7,4, fono raudona spalva yra įvedama galutine koncentracija 1: 40 000. Nustatoma minimali ląstelių, keičiančių terpės spalvą nuo raudonos iki geltonos spalvos (dažniausiai apie 25 000, 0,25 ml), dozė. Tada paruoškite 10 kartų viruso skiedimą, kurių kiekvienas išpilamas į 4-6 mėgintuvėlius, kurie prideda ląstelių suspensiją. Vamzdeliai uždaromi guminiu kamščiu arba įpilama 0,6-0,8 ml vazelino alyvos. Į rezultatus atsižvelgiama išlaikius 5-7 dienas t ° 37 ° temperatūroje. Viruso titras imamas kaip praskiedimas, kuris neleidžia pH pakilti į rūgščią pusę 50% bandinių vamzdelių.

Imuninių serumų gebėjimas neutralizuoti infekcinį virusų aktyvumą nustatomas neutralizavimo reakcija. Serumo titravimo metodai yra iš anksto nustatomi atitinkamų virusų titravimo metodais. Visi jie yra pagaminti iš viruso mišinių su serumu, o po to ištirti neutralizuoto viruso buvimą. Reakcija nustatoma dviem versijomis. Pasak vieno iš jų, imuninis ir įprastas serumas viename praskiedime (pvz., 1:10) sumaišomas su 10 kartų didesnio viruso skiedimu lygiame tūryje, o viruso titras nustatomas esant vienam ir kitam serumui. ED koeficientas50 virusas, esant normaliam serumui jo ED50, esant imuninei būklei, bus atitinkamo imuninio serumo praskiedimo neutralizavimo indeksas. Šis rezultatas negali būti interpoliuojamas dėl kitų serumo skiedimų (pvz., Neatkryptojo serumo aktyvumas bus didesnis už apskaičiuotą). Arba nuolatinė viruso dozė (paprastai maždaug 100 ED50), jungiasi prie dviejų bandinių serumo praskiedimų skaičiaus. Serumo titras bus skiedimas, o Krymo virusas sukels 50% efektą.

Priklausomai nuo viruso titravimo metodo, laboratorinių gyvūnų, viščiukų embrionų (po jų mirties ar hemagliutininų kaupimosi) neutralizavimo reakcija atliekama ląstelių kultūrose (atsiradus citopatiniams pokyčiams, spalvotam bandymui ir kt.). Jei virusas formuoja ospinus ant paukščių embrionų chorioallantoo membranos, nustatomas didžiausias skiedimas serume, dėl kurio ospino kiekis mažėja 50 proc. Ar daugiau. Panašiai serumas titruojamas, sumažinant viruso plokštelių skaičių monolitinių ląstelių kultūrose.

Virusų titravimas pagal DSA ir antikūnus rtga grindžiamas daugybės virusų (myksovirusų, kai kurių poksviruso, adenoviruso, pikornaviruso ir togaviruso virusų) gebėjimu klijuoti raudonųjų kraujo kūnelių. Virus titruojama dvigubais skiedimais, kurių vienodo tūrio 0,5-1% eritrocitų suspensija. Titeriui (1 AE - agliutinacijos vienetui) didžiausia praskiedimas, dėl kurio atsiranda hemagliutinacija (žr.). Hemagliutinuojantis viruso titras nėra jo infekcinės veiklos rodiklis, nes hemagliutinacija) gali sukelti neinfekcines "neišsamias" daleles, inaktyvuotą virusą ir hemagliutinuojantį antigeną, kurį galima atskirti nuo tam tikrų virusų. RTGA serumai titruojami dvigubais skiedimais su 2-4 AE virusu; titras laikomas didžiausiu skiedimu, visiškai slopina hemagliutinaciją).

Kai kurie virusai yra adsorbuojami raudonaisiais kraujo kūneliais, bet nesukelia agliutinacijos. Norėdami juos identifikuoti, galite naudoti netiesioginės hemagliutinacijos reakciją. Jis remiasi eritrocitų, į kuriuos įdėta viruso su šio viruso specifiniu serumu, agliutinaciją. Šis metodas daugiausia naudojamas titruojant serumą.

Komplemento sujungimo reakcija (žr.) Yra tinkama titruojant abu virusus (tiksliau, komplementą rišančius virusinius antigenus) ir antikūnus. Iš esmės CSC su virusais nesiskiria nuo bakterijų ir kitų antigenų. Skirtumai egzistuoja tik antigenų paruošimo metodu. Kaip virusiniai antigenai gali tarnauti kraujas, nasopharyngeal plovimas, šlapimas, pacientų išmatos, užkrėstų organų suspensijos, infekuotų viščiukų embrionų dalys ir ląstelių kultūrose išaugintas virusas. Tinkamiausi kultūriniai antigenai. Užkrėstų organų suspensija prieš vartojimą pakartotinai užšaldoma ir atšildoma, sumaišoma su vienodu eteriu arba chloroformu, sukratoma 1-2 valandas, o po to inkubuojama 18-20 valandų. esant t ° 4 ° temperatūrai, užšaldykite, atšildykite ir apšvieskite centrifuguojant. Norint gauti serumus, gyvūnus neturėtų būti imunizuojamas virusu, kuris buvo kultivuojamas toje pačioje substratoje, kaip reakcijos antigenas. Atsižvelgiant į titravimo tikslą, dvigubi antigeno praskiedimai yra derinami su konkrečia serumo doze arba, atvirkščiai, dvigubais serumo tirpalais su viena antigeno doze. Antigeno, serumo ir komplemento kontaktas atliekamas 1 valandą t ° 37 ° arba 18 valandų. esant t ° 4-6 °. Pridėjus hemo sistemą, medžiaga inkubuojama 30 minučių. esant t ° 37 °. Bendrųjų taisyklių rezultatų įvertinimas.

Yra viruso ir antikūnų titravimo metodai, pagrįsti viruso indikacija užkrėstose kultūros ląstelėse su fluorescuojančiais antikūnais, taip pat daugybė kitų, kurie yra vartojami gana retai.

Toks toksiškumas, kuris būdingas nepažeidžiant virusų, atsiranda neįprastomis sąlygomis įvedus dideles dozes turinčius gyvūnus, o Krom virusas neperima viso reprodukcijos ciklo. Pavyzdžiui, gripo virusas įšvirkščiamas į pelių smegenis arba į veną. Jo toksinis poveikis vertinamas dėl gyvūnų mirties per pirmąją dieną.

Antigeninis viruso (arba vakcinos) aktyvumas nustatomas imunizuojant žmones ar gyvūnus, po kurio antikūnų titras nustatomas jų serume. Imunogeninis vakcinos aktyvumas, t. Y. Gebėjimas sukelti atsparumą infekcijai, nustatomas imunizuojant jautrius gyvūnus virusui. Tada imunizuoti gyvūnai ir kontroliuoti neimmunizuoti gyvūnai yra užsikrėtę virusų skilimo serijomis, apibrėždami jo ED50 abiejoms grupėms. Gautų rodiklių skirtumas apibūdina bandomojo vaisto imunogeniškumą. Jei virusas neturi patogeniškumo gyvūnams, atitinkamos vakcinos imunogeniškumą galima nustatyti tik epidemiolyje. patirtis.

Norėdami ištirti keletą savybių virusų (dydis, struktūra, cheminė sudėtis ir tt), būtina turėti gryną medžiagą su aukštu titru. Dažniausiai naudojamas virusas auginamas ląstelių kultūrose arba užkrėstų viščiukų embrionų alantozės skysčio forma. Valymas paprastai prasideda diferencialine centrifugavimu: pirma, 15-20 tūkst. G (g - gravitacijos pagreitis), medžiaga yra išlaisvinta iš ląstelių nuolaužų, o 50-100 tūkstančių g - pats virusas nusodinamas. Filtravimas per asbesto tarpiklius (pvz., "Seitz"), stikliniai ir celiuliozės membraniniai filtrai (pvz., Miliporės filtrai) taip pat naudojamas atsikratyti didelių dalelių. Fragmentai, kurie yra mažesni už virusus, gali būti pašalinti filtruojant medžiagą per Sephadex gelius, kurie, priklausomai nuo porų dydžio, išlaiko tam tikro dydžio daleles. Išskiriant ir koncentruojant virusą dideliais kiekiais, išpilama amonio ir natrio sulfatų pagalba, nusodinama alkoholiu, aliuminio hidroksidu ar polietilenglikoliu. Norint išlaisvinti balasto baltymus, taip pat naudojamas jų virškinimas proteolitiniais fermentais. Myksovirusai gali būti išgryninti ir koncentruojami adsorbavus eritrocitus žemoje temperatūroje, esant didesniam eliuavimui.

Tolesnis viruso gryninimas ir koncentracija, susidarę taikant vieną ar kitą frakcionavimo metodą. Šie metodai taip pat naudojami atskirti viruso ir atskirų viruso komponentų mutantus. Kai virusas sumaišomas su fazine sistema, sudaryta iš dviejų polimerų vandeninių tirpalų, ji patenka į vieną iš fazių, priklausomai nuo jo dydžio, joninės terpės sudėties, pH ir kt. Didiesiems virusams valyti jie paprastai naudoja sistemą dextran sulfatą - metilceliuliozę, mažesnį - dekstrano sulfatą su polietilenglikoliu. Polimerai, likę po fazės atskyrimo, dažnai šalinami tolimesnio gryninimo metu. Taip pat galite pašalinti dekstrano sulfatą, pridėdamas kalio chloridą, metilceliuliozę su amonio sulfatu, polietilenglikoliu, chloroformu ir kitais metodais.

Virusų, naudojančių kolonėlių chromatografiją, valymas grindžiamas jų sugebėjimu adsorbuoti įvairias chemines medžiagas ir eliuuoti iš jų keičiantis pH arba druskos koncentracijai (žr. Chromatografiją). Adsorbcijai naudojami kalcio fosfato geliai, ląstelių jonų mainai (dažniausiai anijonai, pvz., Diethylaminoethyl celiuliozė), jonų mainų dervos. Viruso eliuavimas iš kalcio fosfato atliekamas su didėjančios koncentracijos fosfatinių buferinių tirpalų ir iš ląstelių bazių jonų mainų su natrio chlorido tirpalais.

Labai išgrynintos suspensijos gaunamos centrifuguojant skystį stulpelyje, kurio tankis paskirstomas tęstiniame gradientu. Virusinės dalelės surenkamos tokiu lygiu, kai terpės tankis yra lygus jų plaukiojančiam tankiui. Zoninis centrifugavimas sacharozės gradientu leidžia atskirti daleles su skirtingomis masėmis. Medžiaga naudojama gradientui, sukurtam laminuojant atitinkamus sacharozės tirpalus. Pasibaigus centrifugavimui, frakcijos surenkamos, vamzdžio apačioje vėrimas. Centrifuguojant pusiausvyrą arba izopicnicą, viruso dalelės suspenduotos cezio chlorido, cezio sulfato arba rubidžio chlorido tirpale. Po ilgo centrifugavimo susidaro stabilus pastovaus tankio gradientas. Pagal viruso dalelių lokalizacijos vietą galima nustatyti jų tankį. Reikėtų pažymėti, kad gautos viruso dalelių tankio ir masės vertės tam tikru mastu priklauso nuo centrifuguojant naudojamos terpės.

Kai V. ir. Virusai, paženklinti įvairiais radioaktyviaisiais izotopais, yra plačiai naudojami. Dažniausiai naudojama anglis yra 14 C, tritis 3 H, fosforas 32 P, sieros 35 S, 131 jodas. Lengviausias viruso žymėjimas, kai jis auginamas ląstelių kultūrose. Radioaktyvumas nustatomas skysčio scintiliacijos skaitikliais arba autoradiografija (žr.).

Chem. virusų sudėtis, ištirta įprastinė cheminė medžiaga. pagal metodus. Nukleino, kuris dažniausiai gauna fenolio ekstrakciją, rečiau naudojamos anijoninės valymo priemonės - dodecilas arba natrio laurilsulfatas.

Norėdami nustatyti virusus (žr.), Visų pirma turėtumėte nustatyti jų lytinę tapatybę. Norėdami tai padaryti, būtina nustatyti viruso dalelių dydį ir struktūrą, nukleorūgšties tipą jų kompozicijoje, lipoidinę membraną. Nukleino rūgšties tipą dažniausiai lemia netiesioginiai metodai, pavyzdžiui, naudojant bromodeksikuridino gebėjimą slopinti DNR turinčių virusų reprodukciją. Lipoido apvalkalo buvimas virusu priklauso nuo jo jautrumo veikiant eteriui ir chloroformui (virusai su voku yra inaktyvuoti). Tolesnis identifikavimas atliekamas su imuniniais serumais nuo žinomų virusų, naudojant įvairias reakcijas - neutralizavimą, CSC, rtga ir kitus. Nustačius, kad gyvūnai yra skiepijami žinomu virusu ir dar neužkrėsta nežinomu arba atvirkščiai.

Bibliografija: virusinių ir ricketcinių ligų laboratorinė diagnozė, red. E. Lennet ir N. Schmidt, trans. su angl., M., 1974, bibliografija; Luria G. E. ir Darn Ell J. E. Generalinė virusologija, trans. iš anglų., M., 1970, bibliografija; Virusologijos ir molekulinės biologijos metodai, trans. Su angl., M., 1972; P. Ш е н и ч-н о v V. A., Semenov B. F. IZeze-r apie EG. Virusologinių tyrimų metodikos standartizavimas, M., 1974, bibliografija; Virusinių ir ricketcinių ligų laboratorinių diagnozių gairės, red. P. F. Zdrodovsky ir M. I. Sokolov, M., 1965; Sokolov MI, S ir N. ir A. A. Y. Ir Remezov P. I. Virusologiniai ir serologiniai tyrimai virusų infekcijose, L., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.

Viruso tyrimo metodai

loading...

Skirtingos viruso tyrimų metodikos ypatybės. Elektronų ir imuninės elektroninės mikroskopijos esmė, reikšmė ir taikymas, imunofluorescencijos metodo specifiškumas. Molekulinės hibridizacijos metodo aprašymas. Elektroninio mikroskopo schema.

loading...

Siųsti savo gerą darbą žinių bazėje yra paprasta. Naudokite žemiau esančią formą.

Jums bus labai dėkingi studentai, magistrantūros studentai, jaunieji mokslininkai, kurie naudos žinių bazę savo studijose ir darbe.

Paskelbta http://www.allbest.ru/

Rusijos Federacijos švietimo ir mokslo ministerija

Aukštojo profesinio rengimo federalinė valstybinė biudžetinė įstaiga

Mokslų fakultetas

Botanikos ir genetikos katedra

Viruso tyrimo metodai

Baigė: Evteeva D.S.

VIRUSŲ TYRIMŲ METODAI

ELEKTRONINĖ VIRUSŲ MIKROSPEKCIJA

MOLEKULINIS HIBRIDIZACIJOS METODAS

NAUDOJAMOS KNYGOS SĄRAŠAS

Virusai, kaip įpareigojantys intracellular parasites, negali augti ant dirbtinių maistinių medžiagų. Jie gali daugintis tik jautriose organizmuose arba gyvuose viruso jautriose ląstelėse.

Nepageidaujamo šeimininko organizmas viruso tyrimui yra naudojamas tais atvejais, kai nėra eksperimentinių sistemų, skirtų virusinių infekcijų patogenezei tirti, kai bandoma virusinių vakcinų sauga arba specifinė viruso sauga narkotikai. Be akivaizdžių pranašumų, metodai turi trūkumų ir apribojimų, susijusių su standartizavimo sunkumais ir rezultatų atkuriamumu, taip pat dėl ​​palyginti didelių eksperimentų išlaidų.

1940 m. Mokslinių tyrimų praktikoje pristatytos ląstelių kultūros radikaliai pakeitė metodologinį virusologijos arsenalą.

Šiuo metu kultūriniai metodai yra esminiai eksperimentinėje ir praktinėje virusologijoje.

Virusologijoje naudojami tyrimo metodai yra labai sudėtingi, visų pirma dėl absoliutaus inkstų ląstelių parazitumo virusų ir jų mažo dydžio.

VIRUSŲ TYRIMŲ METODAI

Virusologijoje naudojami tyrimo metodai yra labai sudėtingi, visų pirma dėl absoliutaus inkstų ląstelių parazitumo virusų ir jų mažo dydžio.

Tiriant medžiagas, gautas iš pacientų, sergančių virusinėmis infekcijomis, siekiant nustatyti šių ligų laboratorinę diagnostiką, naudojami įvairūs metodai:

· Elektroninės ir imuninės elektroninės mikroskopijos metodai;

· Molekulinės hibridizacijos metodas;

· Imunofluorescencinis metodas;

· IgM antikūnų nustatymas.

ELEKTRONINIS MIKROSPEKTYVAS

Elektroninė mikroskopija - tai metodas, skirtas studijuoti struktūras, kurios nėra šviesos mikroskopo apimtys ir kurių matmenys yra mažesni už vieną mikroną (nuo 1 mikrono iki 1 - 5 A).
Elektroninio mikroskopo (APL.1.RIS.1) veiksmas pagrįstas kryptinio elektrono srauto naudojimu, kuris šviesos spinduliuotėje atlieka šviesos mikroskopą, o lęšius atlieka magnetai (magnetiniai lęšiai).

Atsižvelgiant į tai, kad skirtingos tiriamojo objekto dalys sulaiko elektronus skirtingais būdais, elektroninio mikroskopo ekrane elektroniniu mikroskopu ekrane pasirodo juodai baltas vaizdas, padidintas dešimtimis ir šimtais tūkstančių kartų. Biologijoje ir medicinoje dažniausiai naudojami transmisijos tipo elektroniniai mikroskopai.

Elektroninė mikroskopija atsirado 1930-aisiais, kai buvo gauti pirmieji kai kurių virusų vaizdai (tabako mozaikos virusas ir bakteriofagai). Šiuo metu elektronų mikroskopija yra plačiausiai naudojama citologijoje, mikrobiologijoje ir virusologijoje, o tai lemia naujų mokslo šakų sukūrimą. Biologinių objektų elektroninė mikroskopija naudoja specialius narkotikų ruošimo metodus. Tai būtina identifikuoti atskirus tiriamų objektų komponentus (virusą), taip pat išsaugoti jų struktūrą esant aukštos vakuumo sąlygoms elektronų pluošte.

Elektroninės mikroskopijos pagalba tiriama objekto išorinė forma, jo paviršiaus molekulinė organizacija, ištirta objekto vidinė struktūra, naudojant ultrathin sluoksnių metodą.

Elektroninė mikroskopija kartu su biocheminiais, citochimaliniais tyrimais, imunofluorescencija, taip pat rentgeno struktūros analizė leidžia spręsti apie ląstelių ir virusų struktūrinių elementų sudėtį ir funkciją.

Neigiamo kontrasto metodu užkrėstų virusų elektroninė mikroskopija leidžia atskirti virusus ir nustatyti jų koncentraciją. Elektroninių mikroskopų naudojimas virusinių infekcijų diagnozavimui taikomas tik tiems atvejams, kai virusinės dalelės koncentracija klinikinėje medžiagoje yra gana didelė (105 1 ml ir daugiau).

Metodo trūkumas yra nesugebėjimas atskirti virusus, priklausančius tai pačiai taksonominei grupei. Šis trūkumas pašalinamas naudojant imuninę elektroninę mikroskopiją.

Šis metodas grindžiamas imuninių kompleksų formavimu, kai viruso dalelėmis yra pridėta specifinio serumo, tuo pačiu metu yra virusinių dalelių koncentracija, leidžianti juos identifikuoti. Šis metodas taip pat naudojamas antikūnų aptikimui. Siekiant išreikšti diagnostiką, atliekama elektroninė mikroskopinė audinių ekstraktų, išmatų, skysčių iš pūslelių ir nazofaronų išskyros tyrimas.

Elektroninė mikroskopija plačiai naudojama viruso morfogenezei ištirti, jos galimybės išplečiamos, kai naudojami paženklinti antikūnai.

IMMUNELEKTRONINĖ MIKROSCOPIJA

Tai tiesioginė antigeno ir antikūnų sąveikos vizualizacija elektronine mikroskopija, pirmą kartą buvo pasiūlyta 1969 m. J. Almeida ir A. Vatsono virusologiniams tyrimams.

Metodiškai IEM bandymas atliekamas tokia seka:

1. Medžiaga, kuri numato norimo viruso buvimą, sumaišoma ir inkubuojama su standartiniu imuniniu serumu;

2. Virusų antikūnų kompleksas nusodinamas centrifuguojant tinkamais būdais;

3. Atstatomos nuosėdos papildomai kontrasto medžiaga, o gautas preparatas tiriamas elektroniniu mikroskopu.

Teigiamos reakcijos atveju aptikti būdingi agregatai, susidedantys iš viruso dalelių, tarpusavyje sujungtų su antikūnų tiltais. IEM jautrumo riba yra maža: patikimas viruso aptikimas yra įmanomas, kai jo koncentracija pradinėje medžiagoje yra 10 ^ 4 - 10 ^ 6 dalelių viename mililitre.

Metodo pranašumas yra gebėjimas įvertinti ne tik serologinės reakcijos rezultatus, bet ir nustatyti jo morfologinį substratą, t. Y. Nustatyti viruso dalelių formą ir dydį. Esant preparatams, kuriuose yra viruso su žinomu IEM dalelių kiekiu, jis taip pat gali būti naudojamas kiekybiniam antikūnų nustatymui serume, dėl kurio buvo pasiūlyta speciali sistema, kad būtų atsižvelgta į viruso ir antikūnų sąveikos intensyvumą.

Serologiniai virusologijos metodai grindžiami klasikinėmis imunologinėmis reakcijomis: komplemento jungimosi reakcija, hemagliutinacijos slopinimas, biologinis neutralizavimas, imunodifuzija, netiesioginė hemagliutinacija, radialinė hemolizė, imunofluorescencija, imunogeninis fermentas, radioimuninis tyrimas. Sukurtos daugybės reakcijų mikrometodai, jų įranga nuolat tobulinama.

Šie metodai naudojami virusų identifikavimui naudojant žinomų serumų rinkinį ir serodiagnozę, siekiant nustatyti antikūnų augimą antrojoje serume palyginti su pirmuoju (pirmasis serumas yra imamas pirmosiomis dienomis po ligos, o antrasis - po 2 - 3 savaičių). Ne mažiau kaip keturis kartus antikūnų padidėjimas antrojoje serume yra diagnostinė reikšmė. Jei lgM klasės antikūnų nustatymas rodo neseną infekciją, lgC klasės antikūnai išlieka keletą metų, o kartais ir visą gyvenimą. Norint identifikuoti atskirus virusų antigenus ir jų antikūnus sudėtinguose mišiniuose be išankstinio gryninimo baltymų, imunoblotingas naudojamas.

Šis metodas apjungia baltymo frakcionavimą, naudojant elektroakozinį poliakrilamidinio gelio elektroforezę, po to baltymų imuninę sistemą nustatant ELISA metodu. Baltymų atskyrimas sumažina cheminio antigeno cheminio grynumo reikalavimus ir leidžia identifikuoti atskirus antigenų ir antikūnų poras. Ši užduotis yra svarbi, pavyzdžiui, ŽIV infekcijos serodiagnozėje, kurioje klaidingai teigiamų fermentų imunologiniai tyrimai atliekami dėl antikūnų prieš ląstelių antigenus, kurie yra dėl nepakankamo viruso baltymų gryninimo.

Antikūnų nustatymas pacientų serume į vidinius ir išorinius virusinius antigenus leidžia nustatyti ligos stadiją ir populiacijų analizę - virusinių baltymų kintamumą.

ŽIV infekcijos imunoblotingas yra patvirtinamasis testas, skirtas identifikuoti atskirus virusinius antigenus ir jų antikūnus. Analizuojant populiacijas, metodas naudojamas nustatant virusinių baltymų kintamumą.

Didžioji šio metodo reikšmė - tai galimybė analizuoti antigenus, sintetintus naudojant rekombinantinės DNR technologiją, nustatant jų dydį ir antigeninių determinatorių buvimą.

viruso molekulinės hibridizacijos mikroskopas

Immunofluorescencijos metodas arba imunofluorescencijos reakcija (RIF) naudojama mikrobiologinėse laboratorijose, kuriose yra fluorescencinis mikroskopas.

Tyrime buvo taikomos tiesioginės ir netiesioginės imunofluorescencijos reakcijos.

Kai naudojama tiesioginei imunofluorescencijai diagnozuoti, stiklui pritvirtinama klinikinė medžiaga, fiksuota etanoliu.

Tada pridėkite fluorescuojantį serumą. Patikrinkite vaistą fluorescuojančiu mikroskopu.

Antigeno antikūnų imunologinė reakcija atsiranda tiesiai ant skaidrės. Pavyzdžiui, gripo antigenas, kuris yra kartu su paženklintu imunoglobulinu, mikroskopu turi ryškių šviesos dalelių, esančių užkrėstų ląstelių branduolyje ir citoplazmoje. Šis metodas yra paprastas, bet kiekvienam antigeno tipui reikia fluorescuojančio serumo.

Netiesioginės imunofluorescencijos reakcijos esmė yra tai, kad antigenas pirmiausia susietas su konkrečiu (nepažymėtu) serumu ant skaidrės. Liuminescuojantis serumas pridedamas prie antigenų antikūnų komplekso, susidariusio ant stiklo.

Paskutinis etapas yra mikroskopija, kuri identifikuoja paženklintus kompleksus.

Šis metodas suvartoja nedidelį kiekį fluorescuojančių serumų, todėl jis plačiai naudojamas nustatyti bakterijų, ricketcial, pneumocistinių infekcijų.

Tai leidžia lengvai nustatyti gripo virusus, paragripo virusus, adenovirusus, kvėpavimo sincytinius virusus, citomegalovirusą. Legionella ir chlamidijų infekcijų diagnozė taip pat turėtų būti atliekama naudojant imunofluorescencijos testą atitinkamam antigenui nustatyti.

MOLEKULINIS HIBRIDIZACIJOS METODAS

Molekulinės hibridizacijos metodas, pagrįstas virusų specifinių nukleino rūgščių identifikavimu, leidžia aptikti atskiras genų kopijas ir nėra jautrus lygyje.

Reakcija pagrįsta DNR ar RNR (zondų) komplementariųjų grandinių hibridizavimu ir dvigubų struktūrų formavimu. Pigiausias zondas yra klonuota rekombinantinė DNR. Zondas yra paženklintas radioaktyviaisiais pirmtakais (paprastai radioaktyvusis fosforas). Perspektyvinis kolorimetrinių reakcijų naudojimas.

Yra keletas molekulinės hibridizacijos variantų: punktyrinė, blot hibridizacija, sumuštinių hibridizacija, in situ hibridizacija ir tt

NAUDOJAMOS KNYGOS SĄRAŠAS

1) virusinių infekcijų laboratorinė diagnozė, N.N. Nosik, V.M. Stakhanovas

2) Virologijos institutas. D. Ir Ivanovskis RAMS, Maskva; Laboratorinė virusinės infekcijos diagnozė, N. N. Nosik, V.M. Stachanova

loading...

3) žmogaus ir gyvūnų virusų anatomijos ir ontogenezės atlasas, A. A. Avakyan, A. F. Bykovsky, 1970

4) "Virusų planeta", Karlas Zimmeris, 2012 m

5) http://www.serdechno.ru/enciklopediya/3171.html

Ankstesnis Straipsnis

Rūkyti hašišo padariniai

Kitas Straipsnis

Kraujo tiekimas kepenims