Bendrojo baltymo serume nustatymo metodai

Dietos

Bendrosios baltymų koncentracijos serume pamatinės vertės - 65-85 g / l

2. Savitasis svoris serume

3. Svoris (gravimetrinis), kai kraujo baltymai nusodinami, džiovinami iki pastovios masės ir pasveriami analitiniu balansu.

1. Refraktometras IRF-454 B2M

skirtas nustatyti baltymų koncentraciją serume, smegenų skystyje, kontroliuoti vaistų koncentraciją, išmatuoti šlapimo tankį.

2. Cobas integra - bendras proteinas Gen.2

Bandymo principas: dvivalentis varis šarminiame tirpale reaguoja su baltymų peptido jungtimis, kad susidarytų būdingas violetinės spalvos biureto kompleksas.

3. Kraujo serumo baltymo frakcijų nustatymas celiuliozės acetato plėvelės elektroforezės būdu.

Buferinis tirpalas skirtas celiuliozės acetato membranoms serumo baltymų elektroforeziniam atskyrimui, po kurio nustatomas baltymų frakcijų densitometrinis nustatymas.

Baltymų elektroforezės atskyrimo principas yra pagrįstas skirtingais serumo baltymų molekulių judėjimo gretimais tam tikro intensyvumo pastoviu elektriniu lauku. Atskirtos baltymo frakcijos dažomos dažais. Baltymų frakcijos spalvos intensyvumas yra proporcingas jų skaičiui.

Kraujo serumas be hemolizės, lipidozės ir beakterinės. Serumo baltymo frakcijos yra stabilios sandariai uždarytame mėgintuvėlyje 18-25 valandomis 8 valandas, 2-8 dienomis 3 dienas, 20 mėnesių 1 mėnesį.

1. Atlikite elektroforezę

1.1. sausos membranos turi būti kruopščiai išdėstytos ant buferio paviršiaus, skirtos elektroforezei, išvengiant jų greito panardinimo ir atsparios visiškam drėkinimui. Šlapios membranos švelniai nuplaunamos tarp storo filtravimo popieriaus lapų, todėl jie negali išdžiūti. Prieš taikydami mėginius, pageidautina atlikti pirminį fazę Norėdami tai padaryti, įkiškite membraną į elektroforezės kamerą ir 10 minučių įjunkite srovę pasirinktu režimu. Išankstinio fazės fazę galima pakeisti ilgalaikiu membranos mirkymu buferiniame tirpale (kelias valandas).

1.2. naudojant aplikatorių, tiriamus serumo mėginius 2-3 cm atstumu nuo membranos katodo krašto. Įdėkite membraną į elektroforezės kamerą ir prijunkite srovę.

2. Elektroforegramos apdorojimas

2.1. dažyti raudoną S.

Išjungus srovę, atsargiai perkelkite membraną į dažiklio tirpalą 3-5 minutes, po to du kartus 3 minutes 5-7% acto rūgšties tirpale (kol baigiasi balinimas).

1.2. apdoroti elektroforezę naudodama skaitytuvą ir kompiuterinę programą.

4. Tymolio testas

Serumo beta-globulinai, gama-globulinai ir lipoproteinai nusėdo, esant pH 7,55, timolio reagentu. Atsižvelgiant į baltymų frakcijų kiekį ir savitąjį santykį, reakcijos metu susidaro drumstumas, kurio intensyvumas matuojamas turbidimetriniu būdu.

Thymol testas tinkamesnis funkciniam kepenų tyrimui nei koloido atsparūs mėginiai. Manoma, kad jis yra teigiamas 90-100% Botkino ligos atvejų (jau prieš aritinę ir anikterinę) ir toksinio hepatito atvejų. Reakcija yra teigiama po hepatito ir po nekrozės, ypač piketinės cirozės (skirtingai nuo kitų formų cirozės), kolageno ligų, maliarijos ir virusinių infekcijų atvejų. Obstrukcine gelta yra 75% atvejų neigiama, kuri turi diferencinę diagnostikos vertę.

Su obstrukcine gelta, mėginys tampa teigiamas tik tuo atveju, jei parenchiminis hepatitas yra sudėtingas procesas. Diferencijuojant obstrukcinę gelta iš parenchimos, labai svarbu naudoti timolio testą su Bursteino testu (beta ir pre-etilipoproteinams).

Parenchimoje esančioje gelta abiejų mėginių yra teigiami, su mechanine gelta, timolio testas yra neigiamas, Burstein testas yra labai teigiamas.

Paskaita: BENDROSIOS BLUE SERUMO BALTYMŲ NUSTATYMAS

Eksperimentų rezultatai 3 lentelė.

TURINYS ATASKAITA KLAUSIMAI SAVO TYRIMUI

6.1. Kokius baltymų molekulės struktūros organizavimo lygius žinote? Kokie ryšiai yra susiję su jų stabilizavimu?

6.2. Kas yra baltymų denatūracija? Kokios struktūrinės organizacijos yra sunaikintos?

6.3. Kokias denatūravimo priemones žinote? Kokios baltymų molekulės jungtys dažniausiai sunaikina?

6.4. Kuo priklauso nuo tirpumo baltymų? Kokie faktoriai stabilizuoja baltymų tirpalą?

6.5. Kas yra reversinis ir negrįžtamas baltymų nusodinimas? Kokios baltymų nusodinimo reakcijos yra grįžtamos? Kokios baltymų sklaidos reakcijos yra negrįžtamos?

6.6. Kas sukelia negrįžtamus baltymų kritulių reakcijas? Jų taikymas medicinos praktikoje.

6.7. Ar baltymas iš tirpalo krešės esant rūgšties ar šarmų pertekliui? Kodėl?

6.8. Ar baltymų nusodinimas vyks veikiant: 1) mažomis natrio chlorido tirpalo koncentracijomis; 2) didelė natrio chlorido tirpalo koncentracija; 3) mažos gyvsidabrio chlorido tirpalo koncentracijos?

6.9. Kas yra baltymų sūdymas? Kokiu tikslu sūdymas naudojamas medicinoje?

6.10. Kas sukėlė baltymų molekules įkrovą tirpale?

6.11. Pateikite baltymo izoelektrinio taško apibrėžtį. Kaip galima nustatyti baltymą?

6.12. Nustatykite baltymo judėjimo kryptį, kai pI = 4,6, frakcionuojant elektroforeze buferiniame tirpale, kurio pH = 8,2.

BENDROSIOS BALTYMŲ KIEKIO SERUMO NUSTATYMAS

TIKSLINIS DARBAS TESK-TEORETINĖ dalis

Bendrojo kraujo serume (plazmoje) baltymų kiekį galima apibūdinti normos, hipo ir hiperproteinemijos sąvokomis, tai reiškia, kad būdingos normos (neviršijančios fiziologinių svyravimų), mažos arba didelės koncentracijos. Normalus bendras serumo baltymų kiekis yra: suaugusiesiems - 65-85 g / l, naujagimiams - 46-60 g / l, vaikams iki 2 metų - 51-75 g / l, vyresni nei 2 metų - 60-85 g / l.

Bendrųjų baltymų kiekio pokyčiai gali būti ir absoliutūs, ir santykiniai. Pastarieji paprastai yra pažymėti kraujo tūrio padidėjimu (sumažėjimu). Tokiu būdu, polyplasmia ( "vanduo" apsinuodijimo), gausiai infuzijos gliukozės tirpalo ir kitų fiziologinių skysčių, anurija, padidėjusiu antidiuretinio hormono aldosterono ir kad skatinti vandens sulaikymo organizme, veda į vystymosi santykinis hypoproteinemia; per dehidrataciją (dehidrataciją) dėl skysčių praradimo nekontroliuojamos vėmimo, gausus viduriavimas, cholera, cukrinis diabetas, padidėjęs prakaitavimas (karščiavimas), poliureja, santykinė hiperproteinemija.

Daugumoje vidaus ligų kartu su pokyčių baltymų metabolizmo, aptikta hypoproteinemia dėvėti paprastai vidurinį įgytas pobūdį (pirminis hypoproteinemia santykinai retas, ji yra genetiškai nustatytas ir kyla iš genų, koduojančių defektų tam tikras serumo baltymų, pavyzdžiui, - analbumineniya, agamaglobulinemija ir kt.)

Absoliuti hipoproteinemija nustatoma patologijose, kuriose sumažėja biosintezė, padidėja katabolizmas arba padidėja baltymų nuostoliai. Jos dažniausios priežastys yra šios:

1. Nepakankamas su maistu baltymų, dažniausiai yra stebimas su silpno maitinimo badu, auglių, susiaurėjimas stemplės, sutrikimai skrandžio ir žarnyno motoriką funkcija (dėl skilimo baltymų virškinimo ir įsisavinimo maisto ingredientų), kai ilgai uždegimą žarnyne. Pasak A.A. Pokrovskas, netgi nesubalansuota maisto amino rūgščių sudėtis kartais gali sukelti hipoproteinemiją.

2. Parenchiminio hepatito proteino sintezės funkcijos slopinimas, stebimas parenchiminio hepatito metu, taip pat apsinuodijimai, kuriuos sukelia ilgas nudegimo procesas, piktybiniai augliai, kai kurių cheminių nuodų veikimas. Paveiktos kepenų ląstelių, kurios yra formavimo albuminas, fibrinogeno ir imunoglobulinų dalies vieta, negali sintetinti plazmos baltymais pakankamais kiekiais, taip, kad kuriant hypoproteinemia, daugiausia dėl hipoalbuminemija ir hypofibrinogenemia.

3. Padidėjęs baltymų išsiskyrimas organizme, kurį sukelia poreikis kompensuoti dideles energijos sąnaudas, susijusias su plastikinių medžiagų trūkumu (burnos liga, piktybiniais navikais, hipertiroidizmu, hiperkortikumi ir kt.).

4. Burnos praradimas kūne su krauju ūminiu ir lėtiniu kraujavimu, su šlapimu nefrozinio sindromo metu, per pažeista žarnyno gleivinę (enteropatija) ir odą (psoriazė, dideli nudegimai ir kt.).

Sumažintas baltymų kiekis kraujo plazmoje taip pat pastebimas tam tikrose fiziologinėse sąlygose, pavyzdžiui, moterims per pastaruosius nėštumo mėnesius ir žindymo laikotarpiu.

Reikėtų pažymėti, kad norint užtikrinti normalius gyvybinės veiklos procesus, organizmas hipoproteinemijos metu visų pirma naudoja plazmos baltymais esančią albumino dalį. Su padidėjusiu albumino kiekio vartojimu, kuris dažniausiai sukelia kraujo spaudimą kraujyje, susidaro edemos, kurios pasireiškia patologinėse sąlygose, kartu su baltymų kiekio sumažėjimu kraujo plazmoje, mažesne kaip 50 g / l. Taip pat gerai žinoma, kad pusė plazmos kalcio yra surišta su albuminu. Todėl hipoalbuminemiją beveik visada lydi hipokalcemija. Kai taip atsitinka, tik baltymų riba (fiziologiškai neaktyvi) kalcio frakcija mažėja, o tai neskatina tetanyjos ir traukulių. Viena iš svarbių albumino funkcijų yra bivalirubino, laisvųjų riebalų rūgščių ir daugelio vaistų (pvz., Salicilatų, penicilino ir sulfonamidų) jungimas ir transportavimas. Su albinu susiję vaistai nėra fiziologiškai ir farmakologiškai aktyvūs. Reikšmingas plazmos albumino sumažėjimas, dėl kurio sumažėja susirišimas, gali padidinti šių medžiagų laisvųjų frakcijų lygį, dėl kurio gali pasireikšti toksinis poveikis įprastomis vaistų dozėmis.

Absoliutus hiperproteinemija yra palyginti retas reiškinys. Paprastai tai vadinama prieaugis globulino biosintezės korinio ryšio sistemos fagocitines vienbranduolių ląstelių (dėl jų infekcinių arba toksinių stimuliacijos) su ilgais dabartinių lėtinių uždegiminių procesų. Tai pastebima, ypač lėtinio poliartrito, kepenų cirozės ir kai kurių lėtinių procesų metu.

Žymus ir patvari albuminosis - iki 120 g / l, o virš nustatoma iš daugybine mieloma (plazmocitoma), makroglobulinemija Valdenshtrema, todėl plokščių kaulų kaukolės yra papildomų židinių formavimas "nenormalus" arba patologinių baltymų - paraproteins. Todėl, jei pacientas turi didelį viso baltymo kiekį kraujo plazmoje, jis turėtų būti toliau tiriamas, norint identifikuoti šias nenormalių baltymų formas.

Aptikimo nenormalus baltymų kraujo serume (monokloninės gamapatijos) yra dažniausiai nustatomi patologinių būklių, remiantis genezės iš kurių yra piktybinių navikų: mielomatoz, kuris sudaro daugeliu atvejų piktybiniai monokloninės gamapatijos; B-ląstelių limfomos, įskaitant lėtinę limfocitinę leukemiją; ligos, susijusios su imunoglobulino sunkiųjų grandinių anomalijomis, kurios apima retai pasitaikančią ligų grupę, kurios būklė susideda iš H-grandinės fragmento nustatyto nenormalaus baltymo kraujo plazmoje ar šlapime. Krioglobulinemija reiškia paraproteinemijos grupę, kurioje pacientų kraujo plazmoje nustatomi krauoglobulinų buvimai, tarp jų ir baltymai, kurie nusodo kraujo plazmos mėginius žemiau žmogaus kūno temperatūros. Kartais, ypač jei baltymų koncentracija yra didelė, intravaskuliniai krituliai gali sukelti odos pažeidimus, tokius kaip purpura arba Raynaud reiškinys.

Iš to, kas išdėstyta pirmiau, hipoproteinemija beveik visada susijusi su hipoalbuminemija ir hiperproteinemija su hiperglobulinemija.

Daugelyje ligų dažniausiai pasikeičia atskirų baltymų frakcijų procentinis santykis, nors bendras baltymų kiekis kraujo serume lieka normalus. Ši būklė vadinama dysproteinemija. Pavyzdžiui, dėl santykinai nedidelės molekulinės masės reikšmingo albumino kiekio praradimas vyksta sąlygomis, kurioms būdingas biologinių membranų, atskiriančių kraujo plazmą nuo ekstraląstelinio skysčio, pralaidumas. Todėl kūno uždegiminės reakcijos metu, dėl padidėjusio kraujagyslių sienelių pralaidumo, albuminas "išleidžiamas" į intersticinį skystį, dėl kurio sumažėja jo koncentracija plazmoje - hipoalbuminemija. Tačiau šiuo atveju žymiai padidėja globulino frakcijų (daugiausia a-globulinų, kurių sudėtyje yra ūmiosios fazės reagento baltymų arba g-globulinų) kraujo plazma, kuri paprastai nekeičia bendros serumo baltymų koncentracijos. Tuo pačiu metu ryškiai keičia kraujo plazmos baltymų dalis.

DARBO VEIKSMŲ PROCEDŪRA Kiekybinis viso baltymo nustatymas kraujo serume pagal biureto metodą

Šiuo metu žinomi kiekybinio serumo baltymų kiekio nustatymo metodai gali būti suskirstyti į kolorimetrinius, remiantis baltymų spalvinėmis reakcijomis su tam tikrais reagentais; spektrofotometrinė analizė, kurią sudaro absorbcijos laipsnio matavimas ultravioletinėje srityje ir kiti. Tarp kolorimetrinių metodų nusipelno ypatingo dėmesio biureto reakcijai pagrįsti metodai. Jie yra labai tikslūs, praktiškai prieinami ir yra pagrįsti baltymų gebėjimu reaguoti šarminėje aplinkoje vario sulfatu, sudarant kompleksinius violetinės spalvos junginius. Tuo pat metu baltymų ir globulinų susidarančių kompleksų dažymo intensyvumo skirtumai yra nereikšmingi, todėl šį metodą galima nustatyti beveik visiems baltymams serume.

Darbo pažanga

Į 5 ml biureto reagento tirpalo įpilama 0,1 ml serumo. Po to, kai 30 minučių FEKe kolorimetriruyut mėginio kiuvetę su sluoksnio storis yra tarp 10 mm su žalios spalvos filtras (546 nm bangos ilgiui), lyginant su kontrole, kuris yra paruoštas pridedant 5 ml biureto reagento, darbo tirpalo 0,1 ml 0,9% NaCl. Skaičiavimas atliekamas pagal kalibravimo kreivę.

Kalibracinės kreivės konstrukcija. Iš 10% standartinio baltymo tirpalo 0,9% NaCl tirpale paruošiami standartiniai tirpalai, kaip nurodyta 10 lentelėje (0,1 ml bazinio etalono tirpalo yra 0,01 g baltymo). Iš kiekvieno praskiedimo paimamas 0,1 ml darbo tirpalo ir įlašinamas į mėgintuvėlius, kurių sudėtyje yra 5 ml biureto reagento. Po 30-60 minučių išmatuoti standartinių mėginių išnykimą, palyginti su kontrole.

Vidutinės optinio tankio vertės, atitinkančios skirtingas koncentracijas, taikomos milimetriniam popieriui. Standartinių baltymų tirpalų koncentracijos nusėda ant abscisuos ašies, o atitinkamos optinės tankio vertės pateikiamos ant ordinato ašies. Per gautus taškus atkreipkite tiesią liniją.

Duomenys, skirti nustatyti kalibravimo kreivę kiekybiniam viso baltymo koncentracijos serume nustatymui pateikti 4 lentelėje.

Kalibravimo kreivės sudarymo duomenys 4 lentelė

Bendras baltymas, jo vertė ir nustatymo metodai (1 p. Iš 2)

MUZIKOS "PIRMOJI MIESTO KLINIKINĖ SVEIKATOS APSAUGOS MEDICINOS PAGALBA"

ŠIAURĖS VALSTYBINIS MEDICINOS UNIVERSITETAS

KLINIKINIS LABORATORINIS DIAGNOSTIKOS KURSAS

Bendras baltymas, jo vertė ir nustatymo metodai

Archangelskas 2008 m

Kraujo plazmos baltymai

Bendrojo baltymo serume nustatymo metodai

Nuorodos

Baltymai yra aukštos molekulinės organinės azoto turinčios medžiagos, susidedančios iš daugiau nei 20 rūšių alfa-amino rūgščių. Sąlyginė riba tarp didelių polipeptidų ir baltymų yra molekulinė masė 8000-10000. Plazmos baltymai sintezuojami visų pirma kepenyse, plazmos ląstelėse, limfmazgiuose, blužnyje ir kaulų čiulpuose.

Žmogaus kraujo plazmoje yra daugiau kaip 100 įvairių baltymų, kurių kilmės ir funkcijos skiriasi. Iš 9-10% sausos kraujo plazmos liekanų, 6,5-8,5% yra baltymai.

· Paprastas (baltymai) (turi tik amino rūgštis)

· Kompleksas (proteinai) (amino rūgštys ir ne-aminorūgščių komponentai: hemelis, vitaminų dariniai, lipidai ar angliavandeniai)

· Fibrillary (sudarantis daug tankių audinių)

· Globular (albuminas (4-5%), globulinai (2-3%), fibrinogenas (0,2-0,4%)

Yra tokios funkcinės baltymų grupės:

- transporto baltymai (transferinas)

- Ūminės fazės baltymai (C reaktyvus baltymas)

- Neaktyvaus fazės baltymai (albuminas, transferinas)

- Komplemento ir krešėjimo faktoriai (C4 papildas, VIII faktorius)

- Antifermentas (antitrombinas III)

- Baltymai, kurių funkcijos nėra gerai suprantamos (alfa glikoproteinų rūgštis)

Plazmos baltymų fiziologinė funkcija yra išlaikyti koloidinį osmosinį slėgį, plazmos buferinį pajėgumą, kai kuriais atvejais - lipidų molekulių nusodinimą (saugojimą), medžiagų apykaitos produktus, hormonus, vaistines medžiagas ir mikroelementus. Kai kurie plazmos baltymai atlieka fermentinę funkciją, imunoglobulinai atlieka humoralinį imunitetą. Komplemento komponentai ir C reaktyvus baltymas yra svarbūs nespecifiniam atsparumui įgyvendinti, ypač bakterinių infekcijų atveju. Faktorių ir krešėjimo inhibitorių pusiausvyra sąlygoja įprastą būklę kraujo skystą būseną ir greitą krešėjimą sužalojimo atveju.

Kraujo plazmos baltymai

Normable vertė 56,5-66,8 (serumo albumino sudaro maždaug 60% nuo bendros baltymų susintetintas kepenų Albuminas (apie 15g / dieną), o jų pusperiodis yra apie 17 dienų kraujo plazmoje oncotic slėgis, atsiradęs dėl 65-80% Albuminas Albuminai veikti... yra svarbi daugelio biologiškai aktyvių medžiagų, ypač hormonų, transportavimo funkcija. Jie gali susieti su cholesterolio, bilirubinu. Didelė kalcio dalis kraujyje taip pat siejama su albuminu. Albuminas gali derinti su įvairiais vaistais.

Galimi kokybiniai ir kiekybiniai plazmos albumino pokyčiai. Kokybiniai albumino pokyčiai yra labai reti dėl homogeninės šio baltymo frakcijos sudėties; kiekybiniai pokyčiai pasireiškia hiper- ir hipoalbuminemija.

Hiperalbuminemija pastebėta dehidratuojant sunkių traumų, didelių nudegimų, choleros atvejų.

Hipoalbuminemija yra pirminė (naujagimiams dėl nepakankamumo kepenų ląstelėse) ir antrinė, dėl įvairių patologinių būklių, panašių į tuos, kurie sukelia hipoproteinemiją. Sumažėjus albuminų koncentracijai, hemodiliavimas taip pat gali atlikti svarbų vaidmenį, pavyzdžiui, nėštumo metu. Albinų kiekio sumažėjimas mažesnis nei 22-24 g / l kartu su plaučių edemos atsiradimu.)

· Alfa 1 - 3,5 - 6,0 (pagrindinės šios frakcijos sudedamosios dalys yra α1 -Antitripsinas, α1 - lipoproteinas, rūgštis α1 - glikoproteinas) (frakcijos pokytis α1 - Globulinai stebimi ūmaus ir poakčio, lėtinių uždegiminių procesų paūmėjimo; kepenų pažeidimas; visi audinių išsiplėtimas arba ląstelių proliferacija. Sumažinkite α frakciją1 - globulinai stebimi trūkstant α1 - antitripsinas, hipo - α1 - lipoproteinemija.)

· Alfa 2 - 6,9 - 10,5 (frakcija yra α2 - makroglobulinas, haptoglobinas, alipoproteinai A, B (apo-A, apo-B), C, ceruloplazminas) (padidėjusi frakcija α2 - globulinai stebimi visuose ūmių uždegiminių procesų tipuose, ypač su ryškiu eksudatyviu ir grynumu (pneumonija, empiema, kiti gleivinių procesų tipai); ligos, susijusios su dalyvavimu patologiniame jungiamojo audinio procese (kolagenozė, autoimuninės ligos, reumatinės ligos); piktybiniai navikai; atsinaujinimo stadijoje po terminio nudegimo; nefrozinis sindromas; kraujo hemolizė in vitro. Fakcijos sumažėjimas pasireiškia cukriniu diabetu, pankreatitu (kartais), įgimta mechanine kilmės gelta naujagimiams ir toksinis hepatitas. K α2 - Globulinai apima daugiausia ūminės fazės baltymų. Jo turinio padidėjimas atspindi streso reakcijos intensyvumą ir uždegiminius procesus šiuose patologijos tipuose.

· Beta - 7,3-13,0 (β-frakcija, apimanti transferino, hemopexin, papildyti komponentus, imunoglobulino ir lipoproteinų) (didinimo beta globulino frakcijos buvo aptikta pirminės ir antrinės hiperlipoproteinemija, kepenų ligos, nefrozinio sindromo, kraujavimas opa, hipotiroidizmas nuleidimas vertės turinį. Beta-globulinai aptinkami gopo-beta lipoproteinemijos metu.

· Gama - 12,8-19,0 ​​(γ-frakcijoje yra Ig (IgG, bet IgA, IgM, IgD, IgE), taip padidinant gama globulino turinį turi būti nukreiptas į imunitetą reakcijos sistemą, kai išėjimo AT ir autoantikūnai:, esantys virusinių ir bakterinių infekcijų, uždegimas,. kolagenoze, audinių degradacija ir daug nudegimai hypergammaglobulinemia, atspindintis uždegiminis procesas veiklą yra būdinga chroniškai aktyvų hepatitą ir kepenų cirozė didinimas frakcijų y -. globulinai pastebėtas 88-92% pacientų, sergančių lėtinį aktyvų hepatitą (60-65, kurioje% pacientų ji yra labai išreikšta -. 26 g / l ir daugiau) beveik tokie patys pokyčiai pastebėti pacientams, kuriems yra didelė veiklos ir pažangios kepenų cirozė, o dažnai γ-globulinų kiekis viršija albuminas, kuris yra laikomas prastos prognozės ženklas turinį.

Tam tikrais ligų galimai padidėja baltymų sintezę, patenkančių į γ-globulino frakcija, ir pateikiami kraujo patologinių baltymų - paraproteins kuris buvo aptiktomis elektroforezės. Norint paaiškinti šių pokyčių pobūdį reikia imunoelectrophoresis. Panašūs pokyčiai pasireiškė ir mielomai, Waldenstromo liga.

Padidėjimas kraujyje gama globulino, taip pat pastebėtas reumatoidinio artrito, vilkligės, lėtinės limfocitinės leukemijos, endotelioma osteosarkomos, kandidoze.

Γ-globulino kiekio sumažėjimas yra pirminis ir antrinis.

Yra trys pagrindinės rūšys pirminės hipogamaglobulinemiją: fiziologiniai (vaikams, kurių amžius 3-5 mėnesiai), įgimtos ar idiopatinė. Priežastys antrinio hipogamaglobulinemiją gali būti daug ligų ir sąlygos, dėl kurių nyksta imuninę sistemą.

A pasikeitus albumino ir globulino turinio bendro baltymų kiekio pokyčių kryptimi palyginimas suteikia daryti išvadą, kad albuminosis dažnai susijęs su hyperglobulinaemia pagrindą, o hypoproteinemia yra dažniausiai dėl hipoalbuminemija. Anksčiau dažniausiai naudojamas skaičiavimas albumino-globulinas santykis, ty albumino frakcija į globulinas frakcija sumos santykį. Paprastai šis skaičius yra 2,5-3,5. Pacientams, sergantiems lėtiniu hepatitu ir kepenų cirozė, šis santykis yra sumažintas iki 1,5 iki 1, ir net mažinant albumino ir globulino frakcijos padidinti. Pastaraisiais metais vis daugiau dėmesio skiriama apibrėžti prealbumin turinį, ypač sunkiųjų intensyvios terapijos pacientams parenteriniu mitybos. Sumažinti prealbumin koncentracija - anksti ir jautriai testas baltymų trūkumas paciento kūno).

A / G koeficientas paprastai naudojamas kaip albumino ir globulino santykio indeksas.

Pokyčiai šio koeficiento galima pastebėti kepenų cirozės, glomerulonefrito, nefrozinio sindromo, ūmaus hepatito, sisteminės raudonosios vilkligės.

Baltymų koncentracija kraujo plazmoje priklauso nuo jų sintezės ir pašalinimo iš organizmo santykio, taip pat su pasiskirstymo tūriu.

Daugybė baltymų susidaro kepenyse, plazmos ląstelės ir limfocitai sintezuoja imunoglobulinus, komplemento sistemos makrofagus - baltymus. Mažo molekulinio svorio baltymų pasyvus praradimas yra per glomerulus ir žarnyno sieneles. Kai kurie iš šių baltymų pasireiškia reabsorbcija arba yra užfiksuoti ir suskaidyti žarnyno gleivinėje. Daugelis plazmos baltymų po jų užfiksuoto piocitoze yra katabolizuotos kapiliarų endotelio ląstelėse arba mononukleariniuose fagocituose.

Fiziologiniai kraujo baltymų vaidmenys yra daug, pagrindiniai iš jų yra šie:

· Išlaikyti koloidinį-onkotišką slėgį, išsaugant kraujo tūrį, prijungiant vandenį ir jį išlaikant, neleidžiant išeiti iš kraujotakos;

· Dalyvauti kraujo krešėjimo procesuose;

· Išlaikyti kraujo pH nuolatinį stabilumą, sudarant vieną iš kraujo buferinių sistemų;

· Sujungimas su daugybe medžiagų (cholesterolio, bilirubino ir kt.), Taip pat vaistų, juos išleidžia į audinius.

· Palaikyti normalius kraujo katijonų formavimo junginius su jais undialyzed (pvz, 40-50% kalcio koncentraciją serume dėl baltymų, didelė dalis iš geležies, vario, magnio ir kitų mikroelementų yra taip pat susijęs su baltymų);

Bendro kraujo baltymo nustatymo metodai

Viso serumo baltymų nustatymo metodai yra pagrįsti įvairiais principais:

· Spectrophotometric - pagal absorbcijos apibrėžimą esant 280 nm,

· Fotometrinis - spalvotų reakcijos produktų matavimui,

· Refraktometrinis - lūžio rodiklio nustatymas arba šviesos lūžis.

Dažniausiai naudojami refraktometriniai ir fotometriniai biuretai. Biureto reakcijoje vario atomas riboja baltymo azoto atomus, kad sudarytų spalvotus junginius.

Metodo principas: baltymų peptidinės jungtys su vario druskomis šarminėje terpėje formuoja purpurinį kompleksą (biureto reakcija).

Reagentai:

1. Natrio chloridas: 9 g 1 l. vanduo.

2. Kaustinė soda: 8 g. 1 litrui vandens.

3. Kalio jodidas: 30 mmol / l kalio jodido tirpalas 0,2 mol / l natrio šarmo tirpale; 0,5 g kalio jodido dedama į 100 ml matavimo kolbą, pakoreguotą iki žymės 0,2 mol / l natrio hidroksido tirpalu.

4. Kalio-natrio tartrato 4-vanduo (druskos druska).

5. Vario sulfatas 5 vanduo.

6. biureto reagentas: 4,5 g Rochelle druskos yra ištirpinamas 40 ml 0,2 mol / l natrio hidroksido tirpalo yra pridėta 1,5 g vario sulfato ir 0,5 g kalio jodido ir ištirpinama. Įpilkite į 100 ml natrio hidroksido tirpalo 0,2 mol / l. Reagentas yra stabilus, kai jis laikomas tamsiuose stikliniuose induose.

7. Biureto reagento darbo tirpalas: 20 ml biureto reagento sumaišoma su 80 ml 0,5% kalio jodido tirpalu. Tirpalas yra stabilus.

8. Albilino kalibravimo tirpalas: 100 g / l albumino tirpalas 154 mmol / l natrio chlorido tirpale.

Nustatymo kursas: Eksperimentinis tyrimas: 0,1 ml kraujo serumo, įpilama 5 ml biureto reagento darbo tirpalo ir sumaišoma. Po 30 min. Matuojama fotometru kiuvetėje, kurios sluoksnio storis yra 1 cm, esant 500-560 nm bangos ilgiui (žalias filtras), prieš tuščią mėginį. Tuščia: iki 5 ml biureto reagento pridėta 0,1 ml 154 mmol / l natrio chlorido tirpalo, po to apdorota kaip eksperimentinis mėginys. Skaičiavimas atliekamas pagal kalibravimo grafiką.

Kalibravimo kreivės konstrukcija: 10% albumino ruošiamas iš kalibravimo tirpalo. Paimkite 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml; 1,0 ml koreguojamas natrio chlorido tirpalu, atitinkamai, po 1 ml. Pirmojoje vamzdžio koncentracija yra lygi 20 g / l albumino antrąjį - 40 g / l, trečiosios - 30 g / l, ketvirtą - 80 g / l, penktasis - 100 g / l. Iš kiekvieno praskiedimo atsižvelgiant 0,1 ml darbinio tirpalo ir buvo įtraukta į 5 ml darbinio reagento, biureto; per 30- 60 min, buvo matuojamas fotometrui kaip eksperimente nuo tuščio mėginio. Remiantis gautais duomenimis, sukuriama kalibravimo grafika.

Normalios vertės: 65-85 g / l (6,5-8,5 g / 100 ml).

Bendrojo baltymo serume nustatymo metodai

Bendrosios baltymų koncentracijos serume pamatinės vertės - 65-85 g / l

2. Savitasis svoris serume

3. Svoris (gravimetrinis), kai kraujo baltymai nusodinami, džiovinami iki pastovios masės ir pasveriami analitiniu balansu.

1. Refraktometras IRF-454 B2M

skirtas nustatyti baltymų koncentraciją serume, smegenų skystyje, kontroliuoti vaistų koncentraciją, išmatuoti šlapimo tankį.

2. Cobas integra - bendras proteinas Gen.2

Bandymo principas: dvivalentis varis šarminiame tirpale reaguoja su baltymų peptido jungtimis, kad susidarytų būdingas violetinės spalvos biureto kompleksas.

3. Kraujo serumo baltymo frakcijų nustatymas celiuliozės acetato plėvelės elektroforezės būdu.

Buferinis tirpalas skirtas celiuliozės acetato membranoms serumo baltymų elektroforeziniam atskyrimui, po kurio nustatomas baltymų frakcijų densitometrinis nustatymas.

METODO PRINCIPAS

Baltymų elektroforezės atskyrimo principas yra pagrįstas skirtingais serumo baltymų molekulių judėjimo gretimais tam tikro intensyvumo pastoviu elektriniu lauku. Atskirtos baltymo frakcijos dažomos dažais. Baltymų frakcijos spalvos intensyvumas yra proporcingas jų skaičiui.

ANALIZUOJAMI MĖGINIAI

Kraujo serumas be hemolizės, lipidozės ir beakterinės. Serumo baltymo frakcijos yra stabilios sandariai uždarytame mėgintuvėlyje 18-25 valandomis 8 valandas, 2-8 dienomis 3 dienas, 20 mėnesių 1 mėnesį.

ANALIZĖS VADOVAS

1. Atlikite elektroforezę

1.1. sausos membranos turi būti kruopščiai išdėstytos ant buferio paviršiaus, skirtos elektroforezei, išvengiant jų greito panardinimo ir atsparios visiškam drėkinimui. Šlapios membranos švelniai nuplaunamos tarp storo filtravimo popieriaus lapų, todėl jie negali išdžiūti. Prieš taikydami mėginius, pageidautina atlikti pirminį fazę Norėdami tai padaryti, įkiškite membraną į elektroforezės kamerą ir 10 minučių įjunkite srovę pasirinktu režimu. Išankstinio fazės fazę galima pakeisti ilgalaikiu membranos mirkymu buferiniame tirpale (kelias valandas).

1.2. naudojant aplikatorių, tiriamus serumo mėginius 2-3 cm atstumu nuo membranos katodo krašto. Įdėkite membraną į elektroforezės kamerą ir prijunkite srovę.

2. Elektroforegramos apdorojimas

2.1. dažyti raudoną S.

Išjungus srovę, atsargiai perkelkite membraną į dažiklio tirpalą 3-5 minutes, po to du kartus 3 minutes 5-7% acto rūgšties tirpale (kol baigiasi balinimas).

1.2. apdoroti elektroforezę naudodama skaitytuvą ir kompiuterinę programą.

4. Tymolio testas

Serumo beta-globulinai, gama-globulinai ir lipoproteinai nusėdo, esant pH 7,55, timolio reagentu. Atsižvelgiant į baltymų frakcijų kiekį ir savitąjį santykį, reakcijos metu susidaro drumstumas, kurio intensyvumas matuojamas turbidimetriniu būdu.

Thymol testas tinkamesnis funkciniam kepenų tyrimui nei koloido atsparūs mėginiai. Manoma, kad jis yra teigiamas 90-100% Botkino ligos atvejų (jau prieš aritinę ir anikterinę) ir toksinio hepatito atvejų. Reakcija yra teigiama po hepatito ir po nekrozės, ypač piketinės cirozės (skirtingai nuo kitų formų cirozės), kolageno ligų, maliarijos ir virusinių infekcijų atvejų. Obstrukcine gelta yra 75% atvejų neigiama, kuri turi diferencinę diagnostikos vertę.

Su obstrukcine gelta, mėginys tampa teigiamas tik tuo atveju, jei parenchiminis hepatitas yra sudėtingas procesas. Diferencijuojant obstrukcinę gelta iš parenchimos, labai svarbu naudoti timolio testą su Bursteino testu (beta ir pre-etilipoproteinams).

Parenchimoje esančioje gelta abiejų mėginių yra teigiami, su mechanine gelta, timolio testas yra neigiamas, Burstein testas yra labai teigiamas.

Bendrojo baltymo serume nustatymo metodai

Serumo baltymai yra heterogeninė baltymų grupė, įskaitant transporto baltymus, fermentus, imunoglobulinus, hormonus, inhibitorių baltymus ir daugelį kitų. Nepaisant sudėties, struktūros, fizikinių ir cheminių savybių bei atliktos funkcijos skirtumų, išrūgų baltymai turi keletą bendrų savybių:

  1. yra anglies atomų, vandenilio, deguonies, azoto;
  2. susideda iš peptidinių jungčių sujungtų amino rūgščių;
  3. turėti absorbciją spektro ultravioletinėje srityje;
  4. elgtis taip pat ir cheminių reakcijų serijoje.

Remiantis šiomis bendromis savybėmis, buvo išvystyti baltymų nustatymo metodai biologiniuose skysčiuose.

Bendrojo baltymo nustatymo metodai

Tarp visų baltymų koncentracijos nustatymo metodų galima suskirstyti į keletą pagrindinių grupių, pagrįstų skirtingais principais:

  • azoto izometrai;
  • gravimetrinis (svoris);
  • "Krituliai";
  • spektrofotometrinis;
  • refraktometrinis;
  • kolorimetrinis.

Be to, išvardytos pirmiau, taip pat buvo sukurti kiti metodai, tokie kaip fluorimetrinė, poliarimetrinė, taip pat atominės absorbcijos spektrofotometrija ir baltymų aminorūgščių analizės metodai.

Nitometriniai metodai

Azotometriniai metodai nustatant bendrą išrūgų baltymą grindžiami baltymų azoto kiekio nustatymu, susidarant baltymų sudarančių amino rūgščių skilimui. Metodą pirmą kartą pasiūlė Kjeldahlis 1883 m. Pagal Kjeldalio metodą, kuris šiuo metu yra bendro pobūdžio, azotas, esantis baltymuose, oksiduojamas iki amonio jono, o jo kiekis nustatomas titruojant tikslų vandenilio chlorido rūgšties tirpalą. Be to, amonio joną galima nustatyti Nesslero reagentu, manometriniu metodu po amonio jono konversijos į molekulinį azotą hipobromito veikimu arba naudojant Warburgo optinius tyrimus dalyvaujant fermento glutamato dehidrogenazei. Atsižvelgiant į tai, kad iš biologinių objektų baltymų yra vidutiniškai 16% azoto, analizės metu gauto azoto kiekis padauginamas iš koeficiento 6,25. Istoriškai buvo naudojamas faktorius 6,25, nors jo vertė priklauso nuo tiriamo mėginio baltymo sudėties. Individualių baltymų frakcijų serume ar plazmoje faktoriaus dydis svyruoja nuo 5,69 iki 6,52.

Izometrinių metodų trūkumas yra procedūros trukmė ir sudėtingumas, net jei reakcijos metu susidaręs amoniakas gali būti nustatomas fermentiniu metodu. Automatika leidžia kai kuriais atvejais naudoti šį metodą kaip palyginimo metodą dėl jo pakankamo tikslumo ir atkuriamumo.

Gravimetriniai metodai

Gravimetriniai (svorio) metodai nustatyti iš viso išrūgų baltymų yra pagrįsti džiovinimo baltymų iki pastovios masės ir svėrimo analitinio balanso. Metodai yra sunkūs ir šiuo metu praktiškai nenaudojami, norint nustatyti bendrą išrūgų baltymą. Kai kuriose laboratorijose gravimetrinis metodas yra taikomas tam, kad nustatytų fibrinogeną kraujo plazmoje.

"Kritulių" metodai

"Nusodinimo" metodai bendram baltymui nustatyti yra pagrįsti baltymų tirpumo sumažėjimu ir suspenduotų dalelių suspensijos susidarymu įvairių agentų įtaka. Bandomojo bandinio baltymų kiekis vertinamas pagal šviesos sklaidos intensyvumą (nefelometrinės analizės metodas), nustatomą pagal šviesos sklaidos dalelių skaičių arba šviesos srauto slopinimą gautą suspensiją (turbidimetrinės analizės metodas).

Šios metodų grupės rezultatai priklauso nuo daugelio veiksnių: reagentų sumaišymo greičio, reakcijos mišinio temperatūros, terpės pH, užsienio junginių buvimo, fotometrijos metodų. Atsargiai laikytis reakcijos sąlygų skatina stabilios suspensijos su nuolatiniu dalelių dydžiu ir atkuriamais rezultatais susidarymą. "Nusodusių" baltymų serumo nustatymo metodai nebuvo pripažinti ir jie buvo aptikti baltymų nustatymo metu šlapime, smegenų skystyje ir daugelyje atskirų baltymų, naudojant specifinius antikūnus.

Spektrofotometriniai metodai

Spektrofotometriniai metodai nustatyti bendrą serumo baltymą yra pagrįsti ultravioletinių spindulių absorbcijos matavimu.

Baltymų tirpalai absorbuojami esant 270-290 ir 200-225 nm. Absorbcija esant 270-290 nm lemia baltymų molekulės aromatinių amino rūgščių - tirozino, triptofano ir fenilalanino - buvimą. Absorbcija esant 200-225 nm yra beveik 20 kartų didesnė negu 280 nm, daugiausia dėl peptidinių jungčių.

Baltymų nustatymo metodų tikslumas ir specifiškumas, pagrįstas absorbcija esant 270-290 nm, yra nedidelis, nes tirozino ir triptofano kiekis gali skirtis skirtinguose baltymuose serume. Be to, tam tikra paklaida yra laisvųjų amino rūgščių serume - tirozinas ir triptofanas, šlapimo rūgštis ir bilirubinas, sugeriantis 280 nm. Šiuo požiūriu šis metodas nenaudojamas tiesiogiai nustatyti bendrą baltymų kiekį serume.

Priešingai, absorbcija ultravioletinėje srityje - 200 - 225 nm yra daugiausia dėl peptidinių ryšių, todėl įvairių baltymų serumo absorbcijos kiekis šiek tiek skiriasi. Šiame spektro diapazone Alero įstatymas stebimas esant baltymų koncentracijai serume iki 120 g / l.

Bendrojo baltymo kiekis serume, naudojant tiesioginę fotometriją esant 210 nm, pateikia rezultatus, kurie gali būti palyginti su biureto metodu ir Kjeldalio metodu. Tuo pačiu metu šis metodas praktiškai nenaudojamas, nes reikia naudoti kveetą, kuri nejaukia 210 nm ir monochromatoriaus, todėl padidėja metodo kaina.

Refraktometriniai metodai

Refraktometriniai metodai nustatant bendrą išrūgų baltymą yra pagrįsti baltymų tirpalų gebėjimu atsisakyti šviesos srauto. 17,5 ° C temperatūroje vandens lūžio rodiklis yra 1,3332, tuo pačiu temperatūroje serumo lūžio rodiklis skiriasi nuo 1,3480 iki 1,3505. Dėl to, kad elektrolitų ir ne baltymų organinių junginių koncentracija, veikianti jo refrakcijos savybes, yra maža ir gana pastovi sveiko žmogaus serume, kraujo serumo lūžio rodiklio reikšmė visų pirma priklauso nuo jo baltymų kiekio. Priemonė kalibruojama serumu su žinoma baltymų koncentracija. Paprastumas daro refraktometriją patogiu metodu nustatant viso baltymo kiekį kraujo serume, nors daugelyje ligų, ypač cukrinio diabeto, lėtinio inkstų nepakankamumo, jo naudojimas gali sukelti didelę paklaidą.

Kolorimetriniai (fotometriniai) metodai

Kolorimetriniai bendrojo baltymo kiekio nustatymo metodai yra pagrįsti baltymų, turinčių chromogeną sudarančių reagentų, spalvos reakcijas arba dažų nespecifinį susirišimą.

Tarp kolorimetrinių metodų nustatant bendrą serumo baltymą koncentraciją dažniausiai yra biureto metodas, pagrįstas vadinamąja "spalvos biureto reakcija", kurio metu baltymai reaguoja į šarminę terpę su vario sulfatu, kad sudarytų violetine spalva, spalvos intensyvumas priklauso nuo bendro išrūgų baltymas. Biureto metodas nustatyti bendrą serumo baltymą buvo patvirtintas kaip vieningą 1972 m.

Kolorimetriniai metodai nustatyti bendrą serumo baltymą yra gana paprasti ir palyginti pigūs. Metodo trūkumas yra tam tikrų medžiagų (įskaitant narkotikus) trukdantis poveikis.

Kiti bendrojo baltymo serume nustatymo metodai

Fluorimetriniai ir kiti modernūs bendrojo baltymo kiekio nustatymo metodai (pvz., Polarimetrinis mikrometodas arba atominės absorbcijos analizė) turi didelį jautrumą ir specifiškumą, tačiau poreikis įvesti specialią įrangą ir kartais specialiąsias analitikų kvalifikacijas kartu su palyginti didelėmis sąnaudomis nustato šį metodą kaip tiriamąjį turtą. įstaigos ir žymiai riboja jo naudojimą klinikinėje laboratorijoje.

Literatūra:

  • Vadovas "Laboratoriniai tyrimo metodai klinikoje", redagavęs V. M. Меншиков, "Medicina", 1987 m.
  • A.V. Kozlov A. V., Slepysheva V. V. - Baltymų nustatymas serume.
  • Medicinos biochemija: Laboratorijos seminaras, redaguoti N. Semikolenovos A. - Omskas, Omskas valstybinis universitetas, 2005 m.

Susiję straipsniai

Kiekybiniai viso šlapimo baltymų kiekio nustatymo metodai

Bet koks šlapimo mėginys tinka baltymų kiekiui nustatyti. Dauguma tyrėjų nori nustatyti baltymų kiekį šlapime, surinktame per dieną, siekiant nustatyti dienos baltymų praradimą.

Skyrius: Šlapimo analizė

Bendras serumo baltymas

Sąvoka "bendrasis serumo baltymas" reiškia didelį kiekį baltymų, esančių serume, ir skiriasi jų struktūrą, fizikines ir chemines savybes bei funkciją. Visi serumo baltymai yra suskirstyti į albuminus ir globulinus. Be albumino ir globulinų, kraujo plazmoje taip pat yra fibrinogeno, todėl bendras baltymų kiekis kraujo plazmoje yra šiek tiek didesnis nei serume.

Skyrius: Klinikinė biochemija

Bendrojo baltymo kiekis serume pagal biureto reakciją

Bendro baltymo nustatymas biureto reakcija yra labiausiai paplitęs bendras baltymų nustatymo metodas kraujo serume. Šis metodas yra palyginti pigus, paprastas, turi gerą atkuriamumą ir specifiškumą, jo naudojimas leidžia atlikti analizę (automatinę ir pusiau automatinę) ir įprastą fotometrą.

Skyrius: Klinikinė biochemija

Baltymai šlapime: nustatymo metodai

Patologinė proteinurija yra vienas iš svarbiausių ir nuolatinių inkstų ir šlapimo takų ligų požymių. Šlapimo baltymų koncentracijos nustatymas yra esminis ir svarbus šlapimo tyrimo elementas.

Skyrius: Šlapimo analizė

Fotometriniai metodai karbamido nustatymui

Fotometriniai karbamido nustatymo metodai yra pagrįsti karbamido reakcija su įvairiomis medžiagomis, kurių sudėtyje yra spalvotų junginių. Tarp fotometrinių karbamido nustatymo metodų dažniausiai yra metodai, pagrįsti karbamido reakcija su diacetilmonoksime.

Skyrius: Klinikinė biochemija

Veterinarijos technologijos

Jūs esate čia

Bendrojo baltymo kiekis serume pagal biureto reakciją

Principas Baltymai reaguoja į šarminę terpę su vario sulfatu; tuo pačiu metu formuojasi violetinės spalvos dažai.
Reagentai. 1. 0.9% natrio chlorido tirpalas.
2. 0,2 n. (0,2 mol / l) natrio karbonato tirpalas be anglies dioksido. 8 t medžiagos įpilama į 1 l tūrio matavimo kolbą ir supilama į žymę su virinto distiliuoto vandens arba paruošta iš 1 N. (mol / l) natrio šarmo tirpalas: 20 ml 1 n. NaOH tirpalas supilamas iki virinto distiliuoto vandens iki 100 ml.
3. Pagrindinis biureto reagentas. 4,5 g Rochelle druskos (KNaS4N4O6) buvo ištirpinta matavimo kolbą 100 ml 40 ml 0.2N. natrio soda tirpalas. Po to, kai ištirpimo pridedama 1,5 g vario sulfato (SuSO4 * 5H2O) ir 0,5 t kalio jodido (KI). Maišykite iki ištirpinto ir pripilkite iki 100 ml 0,2 N. natrio hidroksido tirpalas. Laikyti indą iš tamsaus stiklo. Reagentų lentynos. 4. 0,5% kalio jodido tirpalas 0,2 n. natrio soda tirpalas. 2,5 g kalio jodido įpilama į 500 ml matavimo kolbą ir pagaminama iki 0,2 n žymos. natrio hidroksido tirpalas. Laikyti tamsioje stiklo pakuotėje ne ilgiau kaip 2 savaites.
5. Biureto reagento darbo tirpalas. Sumaišykite vieną pagrindinio biureto tirpalo (3) dalį su keturiomis 0,5% vandeninio kalio jodido tirpalo dalimis (4). Laikyti šaldytuve tamsioje talpoje ne ilgiau kaip 2 savaites.
6. Standartinis albumino tirpalas, bazinis. Į mėgintuvėlį įpilama 1 g kristalinio serumo (iš žmogaus ar galvijų serumo) albumino ir 9 ml 0,9% natrio chloro tirpalo. Kruopščiai sumaišykite. 1 ml tirpalo yra 0,1 g baltymo. Laikyti šaldytuve. Serumo albuminas turi atitikti standarto reikalavimus.
Įranga. Fotoelektrinis kolorimetras; tūrinės kolbos.
Nustatymo eiga. Į 0,1 ml kraujo serumo pridėkite 5 ml biureto reagento darbo tirpalo, sumaišykite, išvengdami Lena susidarymo. Po to, kai 30 minučių (bet ne vėliau kaip 1 valanda) optinis tankis matuojamas esant FEKe į kiuvetę su sluoksnio storis yra tarp 1 cm, esant 540-560 nm (žalios spalvos filtras), lyginant su kontrolės bangos ilgio (5 ml darbinio tirpalo biureto reagento ir 0,1 ml 0, 9% natrio chlorido tirpalo).
Skaičiavimas atliekamas pagal kalibravimo grafiką, kurio konstrukcija yra pagaminta iš standartinio 10% baltymo standartinio tirpalo (5 lentelė).
5. Darbo standartinių baltymų tirpalų paruošimas
Iš kiekvieno (iš 4) 5 mėgintuvėlių praskiedimų įpilama 0,01 ml albumino tirpalo ir apdorojama, kaip ir kraujo serumas.
Standartinių tirpalų optinio tankio matavimai prasideda mažiausios koncentracijos tirpalu. Pagal gautus vidutinius duomenis iš 5 apibrėžimų sukuriama kalibravimo kreivė. Kalibravimo kreivė periodiškai tikrinama.
PAVYZDYS. 1. Baltymų kiekis standartiniame tirpale turi būti bent 7%. 2. Kai baltymų kiekis serume yra didesnis nei 10%, pastarasis praskiedamas 1: 1 fiziologiniu tirpalu, o rezultatas sumaišomas su dviem. Metodo klaida 2%.
Šaltinis: klinikinė laboratorijos diagnostika veterinarijoje: literatūros leidinys / I.P. Kondrakhin, N.V. Курилов А.Г. Малахов ir dr. -M: Agropromizdatas, 1985.-287s.

Laboratorinė diagnostika

Greita svetainių paieška

Pasidalykite socialiniais tinklais

Perskaitykite:

Rasta klaida? Pasirinkite jį pele ir vienu metu paspauskite Ctrl + Enter Orphus sistemą

Bendras baltymas

Visi žinomi bendrojo baltymo koncentracijos nustatymo metodai skirstomi į šias grupes:

1. Azoto kiekis, nustatytas baltymų azoto kiekio nustatymu, siekiant nustatyti baltymų koncentraciją yra susijęs su tuo, kad azoto kiekis baltymuose yra 16%, todėl taikomas koeficientas 6,25. Šis metodas yra netikslus, nes azoto kiekis įvairiuose baltymų molekuliuose svyruoja nuo 14 iki 19%.

2. Metodai, kuriais nustatomas serumo tankis - plūduriuojančių lašų metodas, taip pat yra netikslūs dėl kitų serume esančių medžiagų tankio poveikio.

3. Svoris (gravimetrinis) - labai daug laiko ir reikalauja didelių serumo kiekių.

4. Refraktometriniai metodai yra paprasti atlikti, bet netikslūs, nes serumo refrakcija taip pat yra susijusi su mineralais ir angliavandeniais.

5. Kolorimetrinis, pagrįstas baltymų spalvos reakcijomis:

  • dažiklio nespecifinės rišamosios medžiagos (paprasta absorbcija) metodai yra gana jautri, tačiau dažų rišimosi laipsnis priklauso nuo atskirų baltymo savybių (metodas su Coomassie blizganti mėlyna).
  • Šiuo metu plačiausiai naudojamas biureto metodas yra pagrįstas specifine peptidinių jungčių reakcija su vario jonais šarminėje terpėje su purpurinio produkto susidarymu. Šio metodo įvairios modifikacijos, siekiant padidinti spalvos intensyvumą ir stabilumą, didinti reagento stabilumą. Pavyzdžiui, tartratas įterpiamas kaip stabilizatorius, kuris, kai komplektuojamas su vario jonais, apsaugo nuo kritulių šarminėje terpėje, KJ neleidžia spontaniškai sumažinti šarminio vario tartrato ir nusodinti vario oksidą, todėl padidina reagento stabilumą. Metodo jautrumas ir specifiškumas priklauso nuo bangos ilgio: 540-580 nm, 263 nm arba 310 nm. Šis metodas laikomas labiausiai specifišku ir tiksliu, nes aromatinių amino rūgščių, fenolių, šlapimo rūgšties nepakanka biureto reakcijai.
  • Lowry metodas - remiantis volframo ir molibdeno Blue mėlyna fosfomolibdeno ir phosphotungstic druskos reagento Folin Chikolte formavimo reagavimą su juos aromatinis amino rūgščių, tirozino liekanų apskritai, bet tam tikras papildomas poveikis yra triptofanas, histidinas, cisteino. Didžiausia absorbcija yra 745-750 nm. Darbinio reagento sudėtyje yra biureto reagentas, kuris leidžia jums nustatyti ir peptidines jungtis. Trūkumai nustatymo būdą: pirma, neigiamai paveikė dėl spalvotų medžiagų vystymosi naudojamas izoliavimo, gryninimo ir soliubilizavimo baltymų (ploviklis, buferinės sistemos, sudėtinių dalių, ir kitų sulfhidrilo sumažinti agentų, purino, glicino, sacharozės kiekiu, amonio sulfato, ir tt); antra, nėra linijinės spalvos intensyvumo priklausomybės nuo baltymų normos kiekio. Šis metodas yra jautresnis nei biureto metodas, tačiau jo specifiškumas yra mažesnis, nes spalvos intensyvumas priklauso nuo amino rūgšties baltymo kompozicijos, taip pat nuo aminorūgščių sudarymo seka ir funkcinių grupių atrankos laipsnio.

6. Nefelometriniai metodai.

7. Polarimetriniai metodai.

8. Spektrofotometrinė analizė, kurią atliekant nustatomas šviesos absorbcijos laipsnis ultravioletinėje srityje dviem bangos ilgiais ir toliau apskaičiuojamas pagal specialias formules (230 ir 260 nm, 280 ir 260 nm, 235 ir 280 nm, 215 ir 225 nm, 280 ir 205 nm).

Vieningi metodai

Vieningieji baltymų nustatymo metodai:

  • kraujo serume - biureto metodas;
  • šlapime - pusiau kiekybinis Brandenbergo-Roberto-Stolnikovo metodas ir nephelometrija (590-650 nm) po reakcijos su sulfosalicilo rūgštimi;
  • smegenų skystyje - nephelometrija (410-480 nm) po reakcijos su sulfosalicilo rūgštimi ir natrio sulfatu;
  • serozinių ertmių skysčiuose - nefelometrija (590-650 nm) po reakcijos su sulfosalicilo rūgštimi.

Bendrojo baltymo nustatymas
kraujo serume pagal biureto metodą

Principas

Baltymai reaguoja į šarminę terpę vario sulfatu, formuojant violetinius chelatinius junginius. Spalvos intensyvumas yra proporcingas peptidinių jungčių skaičiui.